真菌病原体毒力衰减与本地适应对北方蟾蜍生存的影响机制研究

本研究针对两栖类壶菌病病原体Batrachochytrium dendrobatidis（Bd）在实验研究中存在的毒力衰减（in vitro attenuation）和地理起源差异问题，通过对比不同传代次数（1次 vs >15次）和地理来源（科罗拉多本地 vs 巴拿马外来）的Bd菌株对北方蟾蜍（Anaxyrus boreas boreas）的致病性，发现低传代菌株导致宿主生存率显著降低（100%死亡≤20天），且88%既往研究未报告菌株传代历史。结果表明实验菌株选择会显著影响宿主易感性评估，为两栖类疾病生态学研究提供了标准化实验设计依据。

　　

在全球两栖动物种群急剧衰退的背景下，壶菌病病原体Batrachytrium dendrobatidis（Bd）被认为是导致这一生态危机的主要因素。然而，实验室研究中存在一个关键问题：不同研究团队使用的Bd菌株在传代历史和地理起源上存在显著差异，这可能导致研究结果缺乏可比性，甚至产生误导性结论。病原体在体外培养过程中可能发生毒力衰减（virulence attenuation），而使用外来菌株而非本地菌株可能无法真实反映自然条件下的宿主-病原体相互作用。这些实验设计上的选择如何影响对宿主易感性的推断，至今尚未有系统研究。

为解答这一问题，研究人员以濒危物种北方蟾蜍（Anaxyrus boreas boreas）为模型，设计了控制性实验室暴露实验。研究团队从科罗拉多州和怀俄明州两个具有Bd感染历史的种群采集蟾蜍卵，在标准化实验室条件下饲养至变态后3周。实验采用4×2设计（4种处理×2个种群），将蟾蜍暴露于三种不同Bd菌株或空白对照：一是本地低传代菌株（ColoradoFew，从美国牛蛙分离，仅1次传代），二是本地高传代菌株（ColoradoMany，从北方蟾蜍分离，>40次传代），三是外来高传代菌株（PanamaMany，从巴拿马玻璃蛙分离，>15次传代）。所有菌株均属于Bd GPL-2谱系。暴露剂量为10⁶个游动孢子，通过24小时浸泡方式接种，随后进行28天每日存活监测和每周体重测量。

关键技术方法包括：1）使用 Cormack-Jolly-Seber（CJS）生存模型分析每周生存概率，固定检测概率为1（因实验室条件下个体完全可观测）；2）构建23个候选模型检验传代次数（Pass）、地理起源（BdOrigin）、种群来源（Pop）和个体体重（Mass）的效应；3）对58篇已发表Bd暴露研究的菌株信息进行系统调研，评估菌株信息报告完整性。

研究结果

病原体传代历史是生存率主要决定因素

模型选择显示包含菌株特异性处理与体重交互效应的模型支持度最高（AICc权重=0.53）。低传代菌株ColoradoFew暴露组生存率最低，所有个体在20天内死亡（图2）。高传代菌株（ColoradoMany和PanamaMany）暴露组生存率显著较高，且与对照组差异随体重增加而减小（图1）。当个体体重>0.50g时，高传代菌株组的生存概率接近对照组水平。

体重与生存率的非线性关系

体重对每周生存概率有显著影响（所有顶级模型均包含体重效应）。体重<0.50g的个体在所有处理组中生存率均较低，但Bd感染进一步加剧了小体重个体的生存劣势（图1）。对照组最小体重个体（0.2g）的生存概率仍是任何Bd暴露组的2倍以上。体重动态监测显示感染个体出现体重减轻现象，表明可能存在“死亡率漩涡”效应：感染导致体重下降，进而增加对Bd的敏感性。

局部适应证据与地理起源的次要作用

单纯地理起源模型（BdOrigin）未获得支持，但菌株特异性模型揭示细微差异：暴露于本地高传代菌株（ColoradoMany）的个体比暴露于外来高传代菌株（PanamaMany）的生存率略低（图1），提示Bd可能存在对本地宿主的适应性优势。这种差异可能源于菌株的温度适应性差异（ColoradoMany来源地气候与实验条件更匹配）或与宿主的共进化历史。

种群间易感性无显著差异

怀俄明州与科罗拉多州种群的蟾蜍在所有处理中生存概率无显著差异（种群相关模型排名均靠后）。这可能由于高剂量暴露（10⁶游动孢子）掩盖了种群间细微的易感性差异，或与仅使用单一种群缺乏重复有关。

菌株信息报告存在严重缺陷

对58篇Bd暴露研究的调研发现，仅12%研究报告了菌株传代次数，9%报告了冷冻保存历史，而69%报告了分离宿主物种，38%报告了分离年份（图3）。这种报告缺失严重限制了研究间的可比性和结果解读。

研究结论表明，Bd菌株的实验室传代历史是影响宿主生存的最主要因素，低传代菌株更能真实反映自然条件下的病原体毒力。地理起源对宿主生存的影响较小但存在局部适应迹象。个体体重与生存概率呈正相关，且Bd感染会加剧小体重个体的生存劣势。讨论部分强调，使用高传代菌株可能导致对宿主易感性的低估，进而影响保护决策的制定。研究者建议未来研究优先使用低传代本地菌株，并详细报告菌株的传代历史、分离信息和保存条件。这些发现对标准化两栖类疾病研究、提高实验可重复性以及制定有效的壶菌病管理策略具有重要意义。该研究发表于《EcoHealth》期刊，为理解实验设计选择对宿主-病原体研究推断的影响提供了关键证据。