细胞模拟环境中突变亨廷顿蛋白(HD39Q)聚集机制及其在神经退行性疾病中的意义

这篇研究通过荧光光谱(FLS920)、圆二色谱(CD)和纳米颗粒追踪分析(NTA)等技术，系统揭示了巨分子拥挤剂(如Dextran 70、Ficoll 70)如何通过空间位阻效应加速突变亨廷顿蛋白(HD39Q)的聚集进程。研究发现拥挤环境会促进β-折叠形成(ThT荧光增强3.5倍)，并产生异质性寡聚体(FCS显示粒径增加40-60nm)，为亨廷顿舞蹈症(HD)的病理机制提供了新的细胞微环境视角。

　　

章节亮点

化学品与试剂

HD39Q突变体质粒购自Addgene（美国）。巨分子拥挤剂Ficoll 70、Dextran 40/70和PEG 8来自Sigma-Aldrich。实验使用Ni-NTA亲和层析柱（德国Qiagen）纯化蛋白，缓冲液含20mM Tris-HCl（pH 8.0）和150mM NaCl。

稳态荧光分析

采用爱丁堡仪器FLS920荧光光谱仪（激发/发射狭缝3nm）监测HD39Q在0-200g/L拥挤剂中的构象变化。升温实验（5-80°C）显示，340nm处的色氨酸荧光强度随温度升高而递减，提示蛋白去折叠。Dextran 70存在时，荧光猝灭率增加2倍，表明拥挤环境加速构象转变。

HD39Q生物物理表征

圆二色谱（CD）在222nm处出现负峰，证实β-折叠结构形成。加入Ficoll 70后，β-折叠含量从18%增至35%（ΔΔε₂₂₂ = 3.2 mdeg）。纳米颗粒追踪显示，48小时后聚集体的流体力学直径从初始10nm增长至800nm，且Dextran 40组多分散指数(PDI)高达0.4，反映聚集异质性。

结论

荧光相关光谱（FCS）捕获到早期寡聚体（<50nm），其扩散系数比单体低30%。扫描电镜（SEM）观察到Ficoll 70组产生典型原纤维（直径~15nm），而PEG 8组形成无定形聚集体。这些发现揭示了拥挤环境通过体积排斥效应（excluded volume effect）特异性调控HD39Q的聚集途径。

作者贡献声明

第一作者Apurva Mishra负责实验设计与论文撰写；通讯作者Pramit K. Chowdhury提供研究思路与经费支持（SERB资助号EMR/2022/007025）。

利益冲突声明

作者声明无竞争性经济利益。

致谢

感谢印度政府SATHI计划提供的共聚焦显微镜（Picoquant Microtime 200）和超分辨系统（Leica Stellaris 8 STED）。