白僵菌KW1来源新型GH18几丁质酶BbChi3250的生化特性及其与蛋白酶协同降解家蚕蜕皮研究

这篇研究首次报道了白僵菌(Beauveria bassiana)KW1菌株来源的新型GH18几丁质酶BbChi3250的生化特性，揭示其最适pH 5.0、温度30-35°C，对乙二醇几丁质(EGC)的催化效率(kcat/Km)高达596.00 mL·mg-1·s-1。创新性发现该酶与商业蛋白酶CbPro存在显著协同效应（协同度最高达3.41），通过扫描电镜(SEM)直观证实了二者对家蚕蜕皮表层的联合降解作用，为昆虫病原真菌致病机制研究和传统中药僵蚕(Bombyx batryticatus)生产提供了新见解。

　　

基因鉴定与蛋白表达

从传统中药僵蚕分离的白僵菌KW1菌株中鉴定出新型几丁质酶基因Bbchi3250，该基因编码394个氨基酸的成熟蛋白，仅含GH18催化结构域（残基5-349）。系统发育分析将其归类于GH18-A-V亚家族，与已报道的Bbchit1（亚家族D）分属不同进化分支。在大肠杆菌中成功实现可溶性表达，纯化后比活性达4.43 U·mg^-1（胶体几丁质为底物），乙二醇几丁质(EGC)酶活高达8.10 U·mg^-1。

酶学特性解析

BbChi3250为典型酸性中温酶，最适pH 5.0且在pH 6.0-8.5保持75%以上稳定性。热稳定性分析显示其熔解温度(T_m)为36.90°C，但EGC的添加使T_m显著提升10.36°C，暗示底物结合可增强酶构象稳定性。底物特异性实验揭示该酶对可溶性底物EGC的催化效率(k_cat/K_m)比胶体几丁质(CC)高290倍，对酸处理家蚕蜕皮仍保持0.90 U·mg^-1活性。

作用模式与结构基础

高效阴离子色谱(HPAEC-PAD)分析证实BbChi3250为内切型几丁质酶，可将(GlcNAc)₄水解为(GlcNAc)₂，但不降解(GlcNAc)₂。AlphaFold预测的三维结构显示其具有(β/α)₈桶状折叠，底物结合口袋中的E137和Y205可能参与催化，与沙雷氏菌ChiA的催化残基E315/Y390存在结构对应。

协同降解机制突破

首次通过定量与显微技术相结合，揭示BbChi3250与枯草芽孢杆菌蛋白酶CbPro的协同效应：在降解家蚕蜕皮时，0.1U几丁质酶与0.5U蛋白酶组合使N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)释放量提升3.41倍，酪氨酸当量产量增加2.55倍。扫描电镜(SEM)直观显示联合处理组样品表面出现显著纤维解离和孔洞形成，印证了"蛋白酶暴露几丁质纤维→几丁质酶解构骨架→进一步促进蛋白降解"的协同循环机制。

应用价值展望

该研究为白僵菌致病机制提供了分子层面的解释：BbChi3250广泛存在于不同白僵菌和虫草菌株中，其高效降解昆虫表皮的特性可能与其宿主KW1菌株对家蚕幼虫98%的致死率相关。同时，酶-酶协同系统的发现为优化僵蚕生产工艺提供了新思路——通过精确调控几丁质酶与蛋白酶比例，可显著提升真菌对昆虫表皮的穿透效率。此外，该酶对EGC的高效转化能力在几丁质资源高值化利用领域展现出应用潜力。

研究创新性整合了基因组学、酶动力学、结构生物学和显微形态学方法，建立了昆虫表皮降解研究的跨学科技术范式。未来可通过基因敲除/过表达实验进一步验证BbChi3250在白僵菌致病过程中的生物学功能，并探索其与内源蛋白酶组的协同网络。