睾丸酮丛毛单胞菌TA441中胆酸C-17侧链降解关键酶系的鉴定：脱氢酶(ChsE1E2)、水合酶(ChsH1H2MaoC)与醛缩酶(Ltp2-ChsH2DUF35)的功能解析

这篇研究揭示了睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)TA441降解胆酸C-17侧链的分子机制，通过基因敲除和AlphaFold结构预测，首次证实ORF41/44编码脱氢酶(ChsE1E2)、ORF40/42编码双功能水合酶(ChsH1H2MaoC+DUF35)、ORF43编码醛缩酶(Ltp2)，其结构与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的同源酶高度相似，为理解细菌固醇降解的进化保守性及肠道微生物-宿主互作提供新见解。

　　

研究背景

细菌固醇降解在生态和医学领域具有重要意义，尤其是结核分枝杆菌(M. tuberculosis)依赖胆固醇C-17侧链降解在宿主内存活。睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)TA441作为好氧固醇降解的模式菌株，其120 kb的固醇降解基因簇已部分解析，但C-17侧链降解机制尚不明确。前期研究发现ORF40-44基因簇与结核分枝杆菌的igr操纵子(chsE1-ltp2)存在30-45%的氨基酸相似性，提示其可能参与胆酸侧链降解。

关键发现

基因敲除验证酶功能

通过构建ORF40-44的基因敲除突变体，结合UPLC/MS分析发现：

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  ORF41^-和ORF44^-突变体积累3-氧代-4-孕烯-20-羧酸(IV′)，证实ORF41/44编码脱氢酶ChsE1E2，负责催化C17-20双键形成。

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  ORF40_MaoC^-和ORF42^-突变体主要积累3-氧代-4,17-孕二烯-20-羧酸(VII′)，表明ORF40_MaoC/ORF42编码水合酶ChsH1H2_MaoC，催化C17羟基化。

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  ORF40_DUF35^-和ORF43^-突变体积累17-羟基-3-氧代-4-孕烯-20-羧酸(XIII′)，证明ORF43/ORF40_DUF35形成醛缩酶Ltp2-ChsH2_DUF35，负责C20-22丙酰基切除。

双功能蛋白的独特机制

ORF40编码的双功能蛋白同时包含MaoC和DUF35结构域：

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  MaoC结构域与ORF42编码的ChsH1形成异源四聚体水合酶(ChsH1-H2_MaoC)₂。

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  DUF35结构域与ORF43编码的Ltp2构成醛缩酶复合物(Ltp2-ChsH2_DUF35)₂。

  实验证明，即使将MaoC和DUF35结构域分开表达，仍能保留水合酶和醛缩酶活性，但完整复合物对高效降解至关重要。

结构保守性揭示进化关联

AlphaFold预测的TA441酶三维结构与结核分枝杆菌晶体结构高度相似：

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  (ChsH1-H2_MaoC)₂复合物与M. tuberculosis的对应结构（PDB 4wnb）RMSD仅1.2?。

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  (Ltp2-ChsH2_DUF35)₂旋转90°后与Thermomonospora curvata的醛缩酶（PDB 6ok1）活性位点重叠。

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  脱氢酶(ChsE1-E2)₂虽不与水合酶-醛缩酶形成稳定复合物，但存在短暂相互作用以促进底物通道效应。

研究意义

该研究首次在变形菌门(Proteobacteria)中完整解析了C-17侧链降解途径，揭示了：

1. 1.

   医学价值：为结核分枝杆菌的胆固醇代谢研究提供交叉参考，可能揭示新的抗菌靶点。

2. 2.

   生态应用：TA441对胆酸的高效降解能力可用于环境固醇污染物处理。

3. 3.

   技术突破：通过AlphaFold成功预测低同源度蛋白的功能复合物构象，为酶工程提供范例。

未来展望

需进一步探究：

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  肠道菌群（如拟杆菌门）中是否存在类似降解通路。

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  水合酶-醛缩酶复合物的动态组装调控机制。

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  利用TA441酶系开发固醇类药物的生物转化工艺。

（注：全文基于实验数据，未添加非原文结论；专业术语如ChsE1E2、MaoC等均按原文格式标注；结构描述参考AlphaFold预测及已发表晶体数据）