艰难梭菌孢子表面层化学提取方法的评估与标准化研究

这篇研究系统评估了EBB、USD和Laemmli三种化学提取方法对艰难梭菌（Clostridioides difficile）孢子外被层（exosporium）和孢子壳（spore coat）的去除效率。通过透射电镜（TEM）、免疫印迹和溶菌酶触发皮层降解实验，证实EBB和USD能完全去除孢子表面层，而Laemmli处理会残留电子致密物质。研究为孢子生物学研究提供了标准化的提取方案，解决了不同方法导致的跨研究可比性问题。

　　

实验设计与方法创新

研究团队针对艰难梭菌孢子表面层提取的标准化需求，设计了多轮提取-分析的实验流程。通过连续三次EBB（8 M尿素+2 M硫脲+4% SDS+2% β-巯基乙醇）或USD（8 M尿素+1% SDS+50 mM DTT）处理，结合单次Laemmli（1% SDS+5% β-巯基乙醇）处理，系统比较了不同方法对孢子超微结构和蛋白组分的影响。透射电镜显示，EBB和USD处理后的孢子完全失去外被层和孢子壳，仅保留皮层结构，而Laemmli处理组仍残留电子致密物质。

超微结构定量分析

通过ImageJ对孢子直径、皮层宽度和核心直径的测量发现：EBB和Laemmli处理会显著减少皮层宽度（从野生型的106 nm降至70-78 nm），而USD处理对皮层厚度无显著影响。这种差异可能与EBB/Laemmli的煮沸步骤导致皮层肽聚糖（PG）脱水有关。所有处理组孢子直径均减少约40%（从1,000 nm降至600 nm），但核心直径保持不变，证实表面层被有效剥离。

溶菌酶通透性验证

溶菌酶（250 μg/mL）处理实验成为评估孢子壳完整性的关键指标。EBB和USD处理后的孢子2小时内99%变为暗相（phase dark），表明皮层PG完全暴露；而Laemmli处理组仅70%变为暗相，30%保持灰相（phase gray），印证了电镜观察到的残留孢子壳物质。野生型孢子则93%保持亮相（phase bright），证明天然孢子壳能有效阻挡溶菌酶（14 kDa）渗透。

蛋白标记物的提取效率

研究选取五种标志蛋白评估分层提取效果：

1. 1.

   外被层标记：CdeM（23/42 kDa寡聚体）和CdeC（44/55 kDa）在单次EBB处理中即被完全提取，而USD需要两次处理才能清除残留CdeC。

2. 2.

   孢子壳标记：CotA（34/37 kDa）在所有方法中均能被单次提取，但Laemmli处理后的孢子仍残留CotA阳性物质。

3. 3.

   皮层标记：前体SleC（55 kDa）和成熟SleC（37 kDa）在所有方法中均被完全释放。

4. 4.

   核心标记：萌发蛋白酶GPR（37 kDa）仅在溶菌酶裂解后的EBB/USD处理组中检出，证实这两种方法可实现核心蛋白的特异性获取。

技术标准化意义

该研究首次明确：

• •

  EBB在单次处理中即可提取90%孢子表面蛋白，优于USD（74%）和Laemmli

• •

  煮沸步骤（EBB/Laemmli）会导致皮层收缩，而37°C孵育的USD能保持天然PG结构

• •

  三次EBB/USD处理结合溶菌酶消化，可建立从外被层到核心的完整分级提取流程

这些发现为艰难梭菌孢子耐药机制研究、疫苗靶点筛选以及医院消毒策略优化提供了关键技术支撑。例如，完全去除外被层的孢子可用于研究宿主-孢子互作中表面蛋白的功能，而核心蛋白的获取技术则有助于解析休眠萌发的分子开关机制。