池塘净化系统（PPS）通过RhoA/ROCK/MLCK通路增强斑点叉尾鮰肠道发育与屏障功能的机制研究

本研究系统探讨了池塘净化系统（PPS）对斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）肠道健康的多维度影响。结果表明，PPS通过显著改善水质（降低总氮、总磷、化学需氧量（COD）、氨氮与亚硝酸盐，提升溶解氧（DO）），促进鱼类生长性能并增强肠道功能。其机制涉及提升消化酶（胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）与吸收酶（Na+-K+-ATP酶、γ-GT、CK）活性，优化肠道形态（增加绒毛高度、减少黏液细胞），并通过下调RhoA/ROCK/MLCK信号通路增强紧密连接（TJ）与黏附连接（AJ）蛋白（如ZO-1、Occludin）表达，从而改善肠道屏障完整性。

　　

引言

随着水产养殖业集约化发展，水体环境恶化已成为制约行业可持续发展的关键因素。循环水养殖系统（RAS）因其能有效控制水质而受到广泛关注，但其对鱼类肠道健康的影响机制尚未深入揭示。肠道作为鱼类营养吸收和免疫防御的重要器官，其结构完整性、消化吸收功能及细胞连接复合体的调控直接关系到鱼类健康。本研究以斑点叉尾鮰为模型，探究基于RAS原理设计的池塘净化系统（PPS）对其肠道发育、消化吸收功能及连接完整性的影响。

材料与方法

实验于海南大学进行，符合动物伦理规范。将360尾初始体重为243.33±4.43g的斑点叉尾鮰随机分为对照组和PPS组，每组3个重复，饲养60天。PPS系统通过膜曝气生物反应器（MABR）、微滤机、紫外消毒等模块实现水体循环净化。实验期间监测水质参数（包括总氮、总磷、COD、氨氮、亚硝酸盐、溶解氧等），并采集肠道组织与血清样本。通过H&E染色和PAS染色分析肠道形态与黏液细胞数量；采用生化试剂盒检测血清二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LC）及肠道消化酶（胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）和吸收酶（Na⁺-K⁺-ATP酶、γ-GT、CK）活性；通过qPCR和Western blot分析紧密连接（ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin家族）与黏附连接（β-catenin、nectin-2、afadin）相关基因及蛋白表达；并检测RhoA/ROCK/MLCK信号通路蛋白水平。

结果

生长性能与水质参数

PPS组鱼体末重、增重率和特定生长率显著提升（P<0.05）。水质分析显示，PPS组在实验后期（30-60天）的总氮、总磷、COD、氨氮及亚硝酸盐浓度显著低于对照组，溶解氧水平显著升高（P<0.05），pH与温度无显著差异。

肠道健康指标

PPS组血清DAO和D-LC水平显著降低（P<0.05），表明肠道通透性改善。肠道形态学显示，PPS组绒毛高度显著增加（P<0.05），但固有层厚度无变化；PAS染色显示黏液细胞数量显著减少（P<0.05）。

消化吸收功能

PPS组肠道胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性显著升高（P<0.05）；吸收酶Na⁺-K⁺-ATP酶、γ-GT和CK活性亦显著增强（P<0.05），碱性磷酸酶（AKP）活性无变化。

连接蛋白与信号通路

qPCR结果显示，PPS组紧密连接基因ZO-1、ZO-2、Occludin表达显著上调（P<0.05），Claudin-12和Claudin-15表达下调（P<0.05）；黏附连接基因β-catenin、nectin-2、afadin表达下调（P<0.05）。Western blot验证ZO-1、Occludin蛋白表达上调，β-catenin表达下调（P<0.05）。信号通路分析显示，PPS组GPT-RhoA/Total-RhoA比值、ROCK及MLCK蛋白表达均显著降低（P<0.05）。

讨论

PPS通过优化水质参数（如降低氮磷废物、提升溶解氧）为鱼类创造了更健康的生长环境，从而促进其生长性能。肠道形态改善（绒毛高度增加、黏液细胞减少）与消化吸收酶活性增强表明PPS提升了营养利用效率。血清DAO和D-LC水平降低提示肠道屏障功能增强，这与连接蛋白表达变化密切相关：上调的ZO-1和Occludin有助于加强紧密连接结构，而下调的β-catenin可能通过减少细胞迁移促进屏障稳定性。RhoA/ROCK/MLCK通路的下调进一步证实PPS通过抑制肌球蛋白轻链激酶活性，降低肠道上皮收缩性，从而增强连接完整性。

结论

PPS系统能有效改善养殖水质，促进斑点叉尾鮰生长性能，并通过调节消化吸收酶活性和RhoA/ROCK/MLCK信号通路增强肠道屏障功能。本研究为PPS在集约化水产养殖中的应用提供了理论依据，未来需通过细胞与模式生物实验进一步验证其分子机制。