利用脉冲EPR揭示神经元型一氧化氮合酶钳状构象及其对FMN-血红素电子转移的调控机制

来自研究人员利用脉冲电子顺磁共振技术，揭示了神经元型一氧化氮合酶（nNOS）中还原酶结构域间的钳状构象。研究通过双功能自旋标记和蒙特卡洛模拟，发现约55%的oxyFMN蛋白在Tef≈200 K时形成稳定构象（结合能-7.2kTef≈-2.9 kcal/mol），该构象通过限制FMN结构域运动空间，显著促进FMN-血红素电子转移，为优化NOS催化效率提供新机制见解。

　　

神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）作为催化体内一氧化氮生成的关键酶，其结构是由多个结构域通过无序肽链连接而成的同源二聚体。这种特殊的结构布局赋予了蛋白质高度的构象灵活性，而多样化的构象状态对于NOS的生物学功能至关重要，至今仍是研究热点。

本研究聚焦于nNOS各亚基中还原酶结构域之间的对接相互作用。研究人员选取大鼠nNOS中同源二聚形式的氧合酶/黄素单核苷酸结构域构建体（oxyFMN），在其连接氧合酶与黄素单核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）结构域的肽链上的钙调蛋白（calmodulin, CaM）结合区，结合了经过T34C/S38C突变的重组CaM蛋白，并在每个CaM上标记了基于氮氧自由基的双功能自旋标签。通过2?+?1电子自旋回波（electron spin echo, ESE）实验方法，检测到两个自旋标记之间的磁偶极相互作用。

进一步借助蒙特卡洛方法对NOS构象分布进行计算分析，实验结果明确显示：在构象被冻结的有效温度T_ef ≈ 200 K条件下，约55%的oxyFMN蛋白分子采取一种钳形构象，即不同亚基的FMN结构域彼此对接。该对接复合体的稳定能（即对接能）在各向同性相互作用模型下被估算为-7.2kT_ef，约等于-2.9 kcal/mol。

此项发现表明，钳状构象可能作为一种中间态结构，通过限制FMN结构域在对接至血红素结构域过程中的构象空间，促进FMN与血红素之间的跨结构域电子转移，进而显著调节NOS的催化效率。