高等植物光系统I红移吸收的结构决定因素：揭示远红光捕获的精确调控机制

本综述深入探讨了高等植物光系统I（PSI）在植被冠层下富集的远红光环境中通过长波长叶绿素（Chl）增强光子捕获的机制。研究聚焦于Lhca3和Lhca4亚基中的叶绿素对（"红色簇"），结合反向遗传学、高分辨率冷冻电镜（Cryo-EM）和量子力学计算，揭示了电荷转移态（CT）对远红光吸收的关键作用，为设计具有工程化吸收光谱的光捕获复合体（LHC）提供了重要理论基础。

　　

引言

光合生物利用太阳辐射作为主要能源，将二氧化碳和水转化为氧气和糖类。氧合光合作用的光反应涉及两个多聚色素结合蛋白复合体：光系统（PS）I和II，它们串联工作。PSII负责水分解和氧气释放，而PSI介导NADP⁺还原为NADPH，作为还原力的临时储存。PS具有共同的结构，包括包含发生电荷分离反应的反应中心（RC）的核心复合体和增强复合体光吸收截面的天线系统（光捕获复合体，LHC）。尽管有这些相似之处，但它们的光谱特性存在显著差异，PSI表现出红移吸收特性。PSI的最红端吸收源于特殊的Chl对，这些色素在比RC P700更低的能量下吸收，被称为"红色Chl形式"或简称"红色形式"（RF）。

这些色素将吸收能力扩展到远红光光谱（λ ≥ 700 nm），在冠层或密集培养条件下提供优势，其中大多数可见波长被上层叶片吸收，而远红光辐射强烈富集，导致远红与红比例高于5。值得注意的是，尽管RF只占总吸收的一小部分，但它们在远红光富集的光条件下被优先激发。此外，RF在能量转移和捕获方面非常有效，约80%的PSI激发通过这些色素到达P700。由于与这些低能Chl相关的激发态高度 populated，它们可能在光保护和/或激发能量集中方面发挥关键作用。然而，它们的精确生理作用仍有待完全理解。

RF几乎存在于所有类型的PSI复合体中，它们的出现与远红光辐射的可用性密切相关。在蓝藻中，这些色素位于核心复合体内，允许吸收远红光子，导致PSI低温荧光发射峰在730-760 nm之间。在绿藻和苔藓中，红色Chl与LHCI天线系统相关，导致PSI-LHCI荧光发射峰波长分别约为715 nm和722 nm。随着陆地殖民，富含远红光辐射的环境生态位在冠层下变得普遍，导致与LHCI相关的红边Q_Y吸收逐渐增加。事实上，开花植物叶片的PSI-LHCI荧光发射向红移，峰值在730 nm甚至更长。

在高等植物中，LHCI以功能性异二聚体形式结合PSI核心复合体：Lhca1-Lhca4和Lhca2-Lhca3，两者都表现出相似的光谱特性，并在约730 nm发射远红荧光。体外重组重组Lhca复合体（rLhca）显示，远红移主要由二聚体的Lhca4和Lhca3组分引起，并且与这两种LHC特有的特定序列替换有关，其中Asn作为Chl a603的结合残基，而不是在所有其他LHC蛋白中看到的His残基。事实上，Asn（N）与His（H）的替换（a603-NH替换）导致rLhca3和rLhca4复合体中远红吸收和发射形式的完全丢失。假设Asn的存在促进了Chl a603-a609对之间的强激子相互作用，导致电荷转移（CT）特性，最终形成RF。

然而，积累的证据表明，仅Asn与His作为Chl a603配体的替换不能解释自然界中发现的远红光谱特性的变异性。例如，在莱茵衣藻的Lhca2/a4/a9亚基中，Chl a603配体是Asn，发射峰范围在690-717 nm之间，与高等植物Lhca4相比，在700 nm以上的吸收显著降低。此外，a603-HN（H111N）突变虽然在PSII天线复合体Lhcb4中引入了显著的红移（从680 nm到682 nm），但没有实现像在Lhca3或Lhca4的Chl a603-NH突变体中观察到的40 nm位移那样大。

除了相关Chl的排列外，周围的微环境对于优化低能光谱形式可能很重要。PSI-LHCI的结构模型揭示了一个色素簇，包括三个Chl - Chl a603、Chl a609和Chl a615 - 和两个叶黄素（Xan） - L2位点的紫黄质（Vio）和一个叶黄素（Lut）。值得注意的是，Chl a615仅存在于Lhca3和Lhca4亚基中 - 红移亚基 - 而在所有其他LHC蛋白中缺失，无论它们是服务于PSI还是PSII。这一观察提出了其在形成激子相互作用中的潜在作用的问题。

材料与方法

植物材料

拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh koLhca3 koLhca4突变体通过杂交koLhca3和koLhca4 NASC插入系产生。通过根癌农杆菌介导的转化补充koLhca3 koLhca4突变体，产生a603-NH、a615-HA、a615-HI、A3WT-A4WT、A3NH-A4WT和A3WT-A4NH系。

PSI-LHCI样品的纯化和表征

为了纯化PSI-LHCI超复合体，拟南芥植物在植物生长室中生长约6周。在分离程序之前，拟南芥叶片在4°C下暗适应60分钟。按照描述制备未堆叠的类囊体膜。将类囊体膜重悬至Chl浓度为1 mg ml^-1，并加入等体积的2%十二烷基-β-d-麦芽苷（β-DM）进行 solubilization。通过蔗糖梯度超速离心在4°C下分级分离样品。使用汉密尔顿注射器收获含有PSI-LHCI的条带。

对于Cryo-EM制备，将PSI-LHCI样品浓缩至最终体积约800 μl，并通过透析去除蔗糖。最后，将样品浓缩至Chl浓度约1.5-2 mg ml^-1。

PSI核心和LHCI的纯化

从WT和突变体系系中纯化PSI核心复合体和LHCI。简要地说，将来自蔗糖梯度超速离心的PSI-LHCI稀释在5 mM tricine (pH 7.8)中，并使用T-865.1转子离心3小时。将沉淀重悬在含有5 mM Tricine (pH 7.8)和0.05% β-DM的缓冲液中。将Chl浓度调整至0.3 mg ml^-1，并通过加入1% β-DM和0.5% Zwittergent 3-16对样品进行 solubilization。将样品在冰上轻轻搅拌25分钟，然后快速冷冻在液氮中，并缓慢解冻以增强 detached LHCI的产量。通过蔗糖梯度超速离心在4°C下分级分离 solubilized 复合体。

光谱学和色素分析

在室温（RT, 22°C）下记录吸收光谱。在77 K下记录低温吸收光谱。使用荧光光谱仪在低温（77 K）下记录发射和激发荧光光谱。使用光谱荧光计在77 K下记录完整叶片的发射光谱。在4°C下记录圆二色谱（CD）光谱。通过乙腈光谱的反卷积评估LHCI复合体的色素组成。使用高效液相色谱（HPLC）系统进行色素分离和定量。

Cryo-EM样品制备和数据采集

将PSI超复合体在Chl浓度约1.5-2 mg ml^-1下 vitrified。将3微升样品应用于 previously glow-discharged 的Quantifoil R 0.6/1Cu 300-mesh网格上。将网格转移到在200 kV下操作的Talos Arctica，并配备Falcon 3直接电子探测器。分别为WT和a603-NH突变体获取了2716和2601部电影，在标称放大倍数120,000×下，对应于像素大小0.889 ?/像素，在电子计数模式下，标称散焦范围-0.8至-2.4 μm，总剂量40 e^?/?²均匀分布在40帧上。

Cryo-EM数据处理和图像重建

所有图像处理和重建步骤均使用CryoSPARC v.4.4进行。在patch motion correction和对比传递函数（CTF）估计之后，分别使用2313和2257张手动策划的显微照片进行初始颗粒挑选。对于AtPSI-WT，经过几轮2D分类后，最好的类别用于基于模板的自动挑选， resulting in 575,271个颗粒。将颗粒以448 px的盒子大小提取，并经过几轮2D分类。最好的2D类别（282,376个颗粒）用于从头重建（三个类别）和异质 refinement， resulting in 3.74 ?分辨率的初始地图。经过3D分类后，使用局部和全局CTF refinements来确定每颗粒散焦并校正高阶像差（beam tilt和trefoil）和各向异性放大倍数。最好的颗粒在全尺寸下重新提取，并用于最终的非均匀 refinement，获得3.13 ?分辨率的最终密度地图。

对于AtPSI-a603-NH，来自第一轮无参考自动挑选的531,976个颗粒经过2D分类，最好的类别用于在Topaz中训练神经网络。训练好的模型然后用于挑选整个数据集， resulting in 115,589个颗粒。这些颗粒以448 px的盒子大小提取，并经过几轮2D分类后，选择最好的颗粒进行从头重建（3个类别）和异质 refinement， resulting in 4.19 ?分辨率的初始地图。经过两轮3D分类后，对应于最好3D类别的颗粒在没有降尺度的情况下重新提取，并经过局部和全局CTF refinement，进一步进行均匀和非均匀 refinement， yielding 3.29 ?分辨率的最终地图。

在模型构建之前，分别使用全局B因子83.7 ?²和91.8 ?²对WT和a603-NH突变体的地图进行锐化。通过"gold-standard"傅里叶壳相关（FSC = 0.143）准则估计分辨率。在未锐化地图上执行局部分辨率估计。

模型构建和 refinement

使用豌豆PSI-LHCI复合体的高分辨率结构（PDB代码：7DKZ）作为起始模型。在将模型初始对接至地图后，每个蛋白质链独立进行刚体拟合并使用Phenix-refine进行 refinement。使用COOT手动突变不同亚基的氨基酸序列以匹配拟南芥的序列， resulting 模型经过几轮在Phenix中的实空间 refinement 和在COOT中的手动重建。当在密度图中明确识别时，对配体和水分子进行建模，并 refined 到合理的B因子。使用eLBOW生成用于 refinement 的配体约束。使用MolProbity评估最终模型的立体化学质量。使用ChimeraX和PyMol准备高分辨率图。

能量转移和激子耦合计算

使用点偶极近似（PDA）计算激子耦合（EC）。Chl点偶极位于 chlorin 环的四个氮原子的几何中心。Chl Q_Y和Q_X跃迁偶极矩分别与氮ND-NB和NC-NA轴平行对齐。类胡萝卜素（Car）点偶极位于C15原子上，跃迁偶极矩（跃迁S2←S0）与多烯链的中心部分（原子C11–C33）平行对齐。使用Q_Y跃迁偶极矩计算Chls之间的耦合（Chl a–Chl a, Chl a–Chl b, and Chl b–Chl b），而使用Q_X跃迁偶极矩计算Chls和Cars之间的耦合。

使用公式计算两个色素i和j之间的ECs。其中f₁是局部场校正因子，|μ_i|和|μ_j|是色素i和j的跃迁偶极矩的模，ε_r是相对介电常数，这里等于2.4，R_ij是偶极矩向量中心之间距离的模，κ_ij是Chl i和j之间的取向因子。偶极矩值取为4 D、3.4 D和4.5 D，分别对应于Chl a、Chl b和Cars。在ε_r = 2.4的情况下，对于Chl a计算(f₁²μ²)/ε_r为17.6 D²。通过使用Python 3.8的自建代码运行计算。

激发态计算

对来自本工作的Lhca4结构中的Chls进行了量子力学/分子力学（QM/MM）优化和可极化QM/MM激发态计算。在QM/MM计算之前，在纯MM协议中 refined 结构。所有Chls独立优化，除了a603–a609，它们一起优化。对Lhca4中的所有Chls和a603–a609二聚体进行了激发态计算；通过还将L2 Vio与Chls a603和a609包括在内进行了控制计算。采用diabatization程序从二聚体计算中提取CT能量和耦合。最后，构建了一个激子模型，考虑所有Chls的Q_Y态和a603–a609二聚体内的CT态，用于模拟Lhca4的吸收光谱。

统计学

使用OriginPro进行统计分析，使用单向方差分析（ANOVA）；在显著水平P < 0.05下，使用Tukey's post hoc检验分离均值。

结果

用WT或突变型的Lhca3和Lhca4同工型补充了koLhca3 koLhca4拟南芥基因型，其中负责Chl a603结合的Asn被His替换（a603-NH突变体）。在转化了a603-NH突变的植物叶片中，我们观察到77 K荧光发射光谱从736 nm移动到724 nm。

从WT和a603-NH突变体系系中纯化了PSI-LHCI超复合体。RT吸收光谱证实了a603-NH突变复合体中远红光谱形式的丢失，其峰值在704 nm并扩展到750 nm。这伴随着在650-700 nm区域吸收的增加。低温（77 K）发射光谱显示，与WT相比，a603-NH突变体PSI超复合体的发射蓝移了13 nm，其发射峰值在721 nm。约720 nm的发射可归因于PSI核心复合体， leading us to conclude that the a603-NH mutation effectively abolished Lhca-associated RF in vivo。在用WT Lhca3和Lhca4补充的ko植物中纯化的复合体没有观察到发射峰的变化。在Lhca3（A3NH-A4WT）或Lhca4（A3WT-A4NH）中引入a603-NH突变诱导了介于WT和a603-NH基因型之间的光谱特性。

为了评估a603-NH突变对LHCI复合体光谱特性的影响，与PSI-LHCI超复合体相比，我们从WT和a603-NH突变体系系中纯化了LHCI异二聚体（Lhca1–Lhca4和Lhca2–Lhca3）。从a603-NH突变体纯化的LHCI复合体的RT吸收光谱显示，覆盖从680到730 nm范围并峰值在698 nm的宽吸收尾的丢失。WT二聚体的77 K发射最大值记录在728 nm。相比之下，来自a603-NH系的LHCI二聚体显示发射峰在689 nm，突出了约39 nm的显著蓝移。相反，从WT和a603-NH系纯化的PSI核心表现出不变的光学特性，保持峰值在约720 nm。

为了研究a603-NH突变引起的蓝移吸收/发射的结构决定因素，我们确定了拟南芥PSI-LHCI WT和a603-NH超复合体的Cryo-EM结构。最终重建分别以3.13 ?和3.29 ?的分辨率揭示了PSI核心和LHC亚基的明确密度图，允许为两个复合体构建准确的模型。

单个亚基的结构和色素在AtPSI-LHCI WT超复合体内的定位与其他陆地植物中观察到的非常相似。在AtPSI-LHCI WT和a603-NH结构中，不同Lhcas之间色素组成的主要差异在于Chl a : Chl b比率。具体来说，Lhca1/a2/a3各结合14个chl，而Lhca4结合15个Chls。

Chl a615由Lhca3和Lhca4中螺旋C上的His168和His151协调。这些色素在两个结构中显示出清晰的密度图，允许对Chls（包括chlorin环和部分植醇尾）和Vio分子进行精确建模。在Lhca4中，靠近Chl a615的 chlorin 环处发现了一个额外的Xan分子（Lut）。由于这种Lut在发红光的亚基Lhca3中缺失，它不被认为是发红 cluster 的潜在组成部分。

在a603-NH突变体结构中，在103位（Lhca3）和99位（Lhca4）的较大His侧链导致Chl a603 chlorin环位移约0.7 ?，在相应的密度图中清晰可见。Chl a603的 chlorin 环和部分植醇尾在两个WT和a603-NH密度图中都有很好的定义，允许可靠地分配两个结构中Chl a603的位置。令人惊讶的是，Chl a603和Chl a609的 chlorin 环中心之间的距离在两个WT和突变体蛋白之间基本保持不变（Lhca3为9.3 ?对9.1 ?，Lhca4为9.3 ?对9.2 ?），以及两个Chl最近吡咯（环C）中心之间的距离也略有变化，从4.2 ?到4.4 ?在Lhca3中，从4.3 ?到4.6 ?在Lhca4中。

同时，Chl a603和L2中Vio之间的距离从WT中的5.2 ?增加到a603-NH中的5.9 ?，在Lhca3和Lhca4中都从5.3 ?到6.0 ?，变化约12%。

然后我们计算了EC值，这解释了簇中每对色素之间的相对空间取向。Chl a603和Vio之间的EC从WT中Lhca3和Lhca4的534 cm^-1和524 cm^-1下降到a603-NH突变体中的375 cm^-1和384 cm^-1，变化了27-29%。相比之下，a603-NH突变的引入导致Chl a603和Chl a609对之间的EC值变化很小（6-8 cm^-1）。此外，虽然Chl对的EC值在所有Lhca中都在87 cm^-1和101 cm^-1的有限范围内，但WT Chl a603–Vio L2耦合的EC值对于Lhca3和Lhca4显著高于Lhca1和Lhca2，后者不显示红移吸收。值得注意的是，a603-NH突变将Lhca3和Lhca4的ECs降低到与"非红"亚基相当的值。 together, this evidence suggests that the Vio ligand might play a role in tuning the absorption properties of Lhca3 and Lhca4 toward low energy levels.

为了研究Lhca3和Lhca4的L2位点Vio在调节RF诱导相互作用中的作用，我们比较了WT和a603-NH PSI-LHCI的77 K荧光激发光谱，突出了不同波长和相关化学物种对其远红荧光发射的贡献。在480-510 nm区域，其中吸收的最大贡献来自Cars，a603-NH突变体仅显示略低于WT的信号，表明突变体中从Car到Chls的能量转移效率略有降低。图S20(a)中的吸收减去激发（Abs-Exc）光谱之间的差异提供了关于吸收能量在每个波长转移到最低能量发射器的效率的洞察。在480-510 nm区域，a603-NH突变体的Abs减去Exc值略大于WT，表明更强的能量耗散和减少的向Chl a的能量转移，与计算的较低EC值一致。我们继续进一步研究Vio在促进RF中的作用。由于去除L2位点的Vio由于其蛋白质折叠和稳定性的 essential 作用而不可行，我们分析了改变L2占据对PSI-LHCI远红吸收的影响。在npq2基因型中，由于玉米黄质环氧化酶失活，玉米黄质（Zea）在所有位点替换Vio。77 K荧光发射光谱显示，与WT相比，npq2 PSI-LHCI有轻微的约2 nm蓝移。值得注意的是，Vio→Zea交换也导致PSI-LHCI超复合体中表观Chl a/b比率降低，反映在462和492 nm之间吸收增强，与之前的发现一致，然而，这在纯化LHCI二聚体时并未保留。LHCI的色素组成分析也揭示了npq2系中改变的Chl/Car比率，与WT和a603-NH相比，Lut含量显著减少。这被Zea的积累部分补偿。在这种观点下，npq2与WT相比观察到的小光谱差异也可能源于次要因素，例如改变的类胡萝卜素 profiles。

为了分析WT和a603-NH LHCI复合体中的色素-色素相互作用，我们记录了可见区域（350-750 nm）的CD光谱。在Q_Y区域，WT和a603-NH系的光谱都显示出LHC的典型特征峰（即-/+/?），表明相似且保守的结构构象和色素组织。WT和a603-NH复合体的CD光谱揭示了远红区域（λ > 700 nm）的最大差异，其中突变体显示出与负责RF的激子相互作用相关的显著减少的（?）信号。差异光谱（黑线）证明了a603-NH LHCI中低能带（?）的消失（690-730 nm），这被出现在683 nm的高能（+）带补偿。这种保守信号与Chl a603和a609之间激子相互作用的丢失一致，如先前报道。在Soret区域，CD光谱的解释因Chls和Cars信号的叠加而复杂化。在比较a603-NH与WT时，在465和530 nm之间也存在微小差异。然而，这些差异可归因于色素-色素相互作用的实际变化以及纯化过程中Cars的少量损失。

总的来说，我们的结果表明，L2中的Vio，尽管与Lhca3和Lhca4中的Chl a603有强EC，但对a603–a609对的光谱性质和红光吸收只有 modest 影响。

为了在分子水平上模拟a603-NH突变对红移吸收的影响，我们对Lhca4 WT和a603-NH突变体模型进行了基于结构的可极化QM/MM激发态计算，包括电荷转移激发。在用标准激子模型模拟的光谱中（图5c，S22中的noCT），WT和a603-NH都没有表现出实验中观察到的RF的特征，特别是峰值在>700 nm的宽带。相反，通过在计算中加入a603–a609二聚体的CT贡献，我们在WT的模拟光谱中观察到一个低能带（约710 nm），类似于分离的rLhca4中的实验观察。相比之下，突变体的光谱几乎没有变化。这表明WT/a603-NH吸收位移的主要贡献在于Chl a603–a609之间CT态与局部激发的耦合程度不同，支持了先前的提议。CT对激子态能量的影响类似，无论CT方向如何；因此，我们在计算中包括了两个CT态（a603+ a609?和a603? a609+）。结果发现，两个CT态都与Q_Y态耦合，但a603+ a609?的能量显著低于相反态。因此，我们可以得出结论，负责红色形式的WT Lhca4的最低激子态是激子和CT态的混合物，具有较大的a603→a609 CT成分。

我们还评估了Chl二聚体和L2 Vio之间的电子相互作用。为此，我们计算了两个超分子的激发态，一个由a603和a609形成（二聚体），另一个由相同的两个Chls和Vio形成（三聚体）。我们研究了负责荧光发射的最低激发态的能量，以探讨包括或排除Vio对电子结构的影响。当比较二聚体与三聚体超分子时，对于a603-NH和WT，分别观察到约15和70 cm^-1的变化，表明L2中的Vio在调节簇的低能吸收中 marginal 参与，与我们的实验结果一致。然而，这部分差异已经通过Vio的不同处理（在二聚体中作为点电荷 vs 在三聚体中作为活性分子）解释。因此，这种差异不足以得出结论，认为L2中的Vio有效地将其轨道与两个Chls混合或有助于a603–a609对内的CT激发。我们得出结论，WT和a603-NH物种之间的差异（Δ）并未因Vio的 inclusion 而显著改变。

Lhca3和Lhca4结合了一个额外的Chl分子，a615，它由位于Lhca3和Lhca4的C螺旋的第三个或第四个转折上的His残基协调。这种色素在"蓝色"亚基Lhca1和Lhca2中缺失，导致推测其参与RF形成，因为Chl a615的定位允许与Chl a609有利的偶极耦合。值得注意的是，Chl a615和Chl a609之间的EC值对于Lhca3为79 cm^-1，而在Lhca4中由于 chlorin 环相对于Chl a609的不同取向下降到19 cm^-1。尽管His残基也存在于Lhca1和Lhca2的C螺旋的第二个转折中，但Cryo-EM中电子密度的缺乏表明Chl a615在这些亚基中缺失。

在Lhca4中，靠近Chl a615的 chlorin 环处发现了一个额外的Lut分子，其定位允许与这个Chl强偶极耦合（492 cm^-1）。这种Lut先前仅在玉米PSI-LHCI的Cryo-EM结构（PDB 5ZJI）和豌豆PSI-LHCI的X射线结构（PDB 4XK8）中观察到。Lut位于Lhca1和Lhca4之间的界面处，与两个亚基接触，并且其一个羟基与Lhca1中的Ser210的羰基氧形成氢键。因此，它可能在单体Lhca4的纯化过程中丢失。

为了研究Chl a615在远红光吸收中的潜在作用，我们通过在两个Lhca3和Lhca4中将His结合残基替换为非结合Ala（a615-H→A）或Ile（a615-H→I）产生了缺少这种色素的突变体。来自a615-HA和a615-HI突变体系系的类囊体