拟南芥（Arabidopsis thaliana）硼限制耐受性的广泛种内变异及与多效性基因座相关的根与茎性状恢复力

本研究系统评估了185个拟南芥种质在硼（B）限制条件下的表型、离子组及分子响应，揭示了硼效率的广泛自然变异。研究鉴定出7个高硼效率种质，其在硼限制下生物量减少<20%，并发现侧根生长的维持是硼效率的关键特征。全基因组关联分析（GWAS）鉴定出染色体4上一个与根和茎硼限制恢复力相关的数量性状基因座（QTL），提示优化根系结构有助于在硼限制条件下维持地上部生产力。研究还发现硼效率与硼转运蛋白（NIP5;1、NIP6;1、BOR1）表达无直接相关性，而与硼利用效率提高相关，且系统发育分析表明硼效率在不同地区独立进化多次。该研究为解析植物硼效率的分子调控机制提供了重要资源和策略。

　　

引言

硼（B）是维管植物的必需微量元素，其在植物细胞壁果胶组分中形成鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II（RG-II）单体间的二酯键，从而决定细胞壁的完整性、可塑性和稳定性。在细胞水平，硼对细胞壁特性、质外体运输和区室化过程、膜稳定性、细胞生长和分化、花粉发育、花粉管生长、机械感应和病原体穿透抗性等具有重要生化作用。在宏观水平，硼缺乏会导致根和茎的心腐病、病原体易感性、根和茎分生组织活性受损、形态异常（如发育迟缓、叶片卷曲、萎蔫和叶色加深）以及花发育和育性受损。这些损害共同导致植物性能、胁迫耐受性降低，最终导致产量下降。全球范围内，硼是作物中最常缺乏和主动管理的微量元素之一，硼施肥对于实现最佳农业产量和质量至关重要，即使在需硼量相对较低的谷物中也是如此。为了培育硼高效品种，必须了解植物硼效率的生理和分子机制。

材料与方法

研究选择了185个拟南芥种质，基于其预期的基因型变异和代表不同土壤硼有效性的多样化起源。植物在自动化表型系统中使用无硼（<0.1 mg B kg^?1）或硼充足（2.5 mg B kg^?1）的土壤基质进行培养，并在琼脂平板上（0.2 μM 或 100 μM 硼酸）进行体外培养。表型测量包括地上部生物量、根系结构、离子组（ICP-MS）和硼转运蛋白基因（NIP5;1、NIP6;1、BOR1）的表达分析。使用214,051个单核苷酸多态性（SNP）进行系统发育分析和全基因组关联分析（GWAS），使用R包gapit和farmcpu方法。k-均值聚类用于根据38个根和茎性状比率对种质进行分组。

结果

硼限制强烈抑制大多数拟南芥种质的营养生长

在自动化表型系统实验中，大多数种质在硼缺乏处理下表现出典型的缺硼症状，主要表现为地上部生长减少、叶片披针形、叶片卷曲和叶色深绿。硼转运蛋白突变体nip5;1在缺硼条件下未能发育超过萌发阶段，证实了缺硼生长条件的成功建立。在实验的七个成像日中测量的329个性状中，94个性状在缺硼条件下比硼充足条件下平均高出或低出20%以上，表明硼限制引起了广泛的破坏。其中大多数（73个）仅在播种后13天（DAS）出现，此时种子硼储备和有限的土壤硼不再足以维持未受干扰的生长。虽然大多数种质继续生长直至收获，但缺硼植株生长速度较慢。这反映在投影叶面积（PLA）上，其在20 DAS时与地上部干重（DW）密切相关。在硼充足条件下，第16天植株的PLA比第9天平均大13.7倍，而缺硼植株仅大8.5倍。平均而言，种质在缺硼条件下第9天和第16天的PLA分别比硼充足条件减少了22%和52%。参考种质Col-0对缺硼特别敏感，在第16天时，缺硼条件下的PLA比硼充足条件减少了71%。收获时（20 DAS）的地上部鲜重（FW）在缺硼条件下平均比硼充足条件低62%。Col-0植株的地上部FW在缺硼条件下平均比硼充足条件低80%。

与数字地上部生物量积累相比，地上部几何、结构和颜色相关表型对硼限制的响应更早

为了识别与硼限制下生物量积累恢复力相关的地上部行为，特别是那些在植物发育早期就能区分的行为，研究人员检查了自动化表型系统中测量的多种性状。植物凸包面积（定义为围绕每个莲座丛绘制的最小凸多边形的面积）在时间上对缺硼的响应通常遵循PLA，即所有种质在硼处理之间的明显差异首先在大约12 DAS变得清晰。然而，凸包点数量（即凸包边缘点的数量）从9 DAS开始就对缺硼产生响应。在所有条件相同的情况下，具有较少凸包点的莲座丛需要更少的点来绘制单个叶片的凸包，这意味着披针形叶片的出现率更高，这是拟南芥缺硼的典型症状。在9 DAS时，暴露于硼限制的植株平均比在硼充足条件下生长的植株凸包点数量少24.6%。由于PLA和叶片计数至少在12 DAS之前在处理之间仅略有差异，从9 DAS开始观察到的凸包点数量在处理之间的差异表明，叶片和莲座丛形状在生物量积累受到影响之前就对缺硼做出了响应。事实上，叶宽在9 DAS时也受到硼限制的负面影响，此时它比在硼充足条件下生长的植株平均窄11.4%。这些结果表明，硼限制从发育早期就诱导了叶片细胞分裂和扩张的限制，表现为缺硼拟南芥植株典型的披针形叶片。

颜色相关表型在9至12 DAS期间占处理间差异超过20%的性状比例（23%）高于13至16 DAS（15%）。RGB绿色值在所有成像日在缺硼生长条件下通常较低，从减少7%（9 DAS）到减少11%（16 DAS）。黄色与绿色像素比率和棕色与绿色像素比率也对缺硼有响应。然而，这些性状在处理之间的差异通常首先出现在15至16 DAS；因此，代表了实验后期发生的颜色变化。为了评估这是否对光合作用有影响，使用FluorCam设备在16 DAS测量了光合操作效率。与预期相反， across accessions，缺硼植株的光合操作效率平均比硼充足条件高4.7%。然而，在缺硼条件下，光合操作效率与地上部FW、地上部DW或第16天PLA之间未观察到显著相关性。这一结果表明，缺硼在实验持续时间内对光合操作效率仅有边际影响。

拟南芥群体中存在高硼效率种质

为了识别群体中最硼高效的种质，所有种质被分配了一个地上部硼效率指数（BEI_shoot，同时考虑了20 DAS时的FW比率和16 DAS时的PLA比率。平均BEI_shoot为0.230，范围从0.016（Kz-1）到1.521（Var2-1）。拟南芥参考种质Col-0在该研究中排名第156位（共185个种质），BEI_shoot为0.057。种质的BEI_shoot分数呈右偏分布，Shapiro-Wilk检验拒绝正态性（P < 0.001），表明群体中硼低效种质富集，提示硼效率在拟南芥中很罕见。因此，114个种质（群体的62%）的BEI_shoot分数低于群体平均值。BEI_shoot第90百分位的19个种质被认为是硼高效的（Var2-1, Hn-0, Yo-0, Cha-0, Tha-1, Db-0, Cal-0, Ty-0, Sorbo, Cvi-0, Ca-0, CUR-3, TOU-A1-116, Es-0, Zü-1, N7, Eden-1, Com-1和Ge-1）。这些种质的BEI_shoot值均高于0.478。在这些种质中，Var2-1、Hn-0、Yo-0、Tha-1、Ca-0、Db-0和Cha-0（7/185）在缺硼条件下维持了>80%的地上部FW和DW（与硼充足条件相比），因此被认为是高耐缺硼种质。Hn-0、Yo-0和Var2-1的地上部DW在缺硼条件下甚至分别比硼充足条件高2%、3%和33%。然而，所有这些种质（除Ca-0外）在硼充足条件下的地上部DW低于群体平均值。事实上，在19个最硼高效（BEI_shoot第90百分位）的种质中，有13个是如此，这表明在缺硼条件下旺盛的生物量形成并不自动与在硼充足条件下旺盛的生物量形成相关联。同时，两个硼高效种质Cal-0和Es-0的地上部FW和DW在硼充足条件下处于第80百分位（37个表现最佳的种质），这表明这些种质不仅硼高效，而且通常生长旺盛。11个BEI_shoot值高于0.400的种质被认为是硼中度高效的（Kn-0, Bl-1, Kas-2, Bs-1, S96, Liarum, In-0, Kondara, Je-54, Zdr-1和Co）。所有硼高效或硼中度高效的种质在缺硼条件下维持了>63%的第16天PLA以及>62%的地上部DW和>56%的地上部FW（与硼充足条件相比）。此外，在缺硼条件下，所有硼高效种质在实验结束时的地上部FW高于群体平均值，19个硼高效种质中的17个在第16天的地上部DW和PLA高于群体平均值。两个地上部DW和第16天PLA低于群体平均值的种质（Tha-1和Db-0）仍然被认为是硼高效的，因为它们能够维持其各自在硼充足条件下地上部FW、地上部DW和第16天PLA的80%以上。在其余种质中，我们将BEI_shoot超过第10百分位的136个种质定义为硼低效品系，将BEI_shoot第10百分位（<0.043）的19个种质定义为高度缺硼敏感种质（Ga-0, Hovdala-2, Pa-1, Rmx-A02, Hau-0, Tu-0, Tsu-1, Ri-0, Alc-0, Kin-0, Nz1, Ull2-3, Van-0, Bay-0, WAR, Duk, RLD-2, Gel-1和Kz-1）。代表性的硼高效（Es-0）、硼低效（Wag-3、Wil和Uod-1）和高度缺硼敏感（Kin-0）种质以及nip5;1敲除突变体显示在图中，每种情况都按随机完全区组设计分组在载体上。最能维持缺硼条件下生物量积累的种质通常是那些在营养充足条件下生物量积累低于平均水平的种质。然而，群体中存在在硼充足和缺硼条件下都具有高生产力的种质，表明在拟南芥中存在在这两种情况下都赋予活力的性状。

缺硼降低地上部硼浓度，但在硼高效和硼低效种质中降低程度相似

使用从自动化表型实验20 DAS收获的地上部组织测定了43个种质的离子组。硼高效种质由19个硼高效种质中的17个和5个硼中度高效种质代表。硼低效种质由19个高度缺硼敏感种质中的17个和4个硼低效种质代表。硼高效种质在硼充足（平均高11%）和缺硼（平均高40%）生长条件下通常比硼低效种质具有更高的硼浓度。然而，两组受到缺硼的影响相似，与硼充足条件相比，硼高效和硼低效种质的地上部硼浓度平均分别降低了84%和87%。在硼充足生长条件下，硼低效种质的地上部硼浓度在51.1 mg kg^?1 DW（Tsu-1）和79.9 mg kg^?1 DW（WAR）之间变化，硼高效种质在55.9 mg kg^?1 DW（Var2-1）和91.7 mg kg^?1 DW（Hn-0）之间变化。缺硼生长条件下的地上部硼浓度在硼低效种质中在5.1 mg kg^?1 DW（Hau-0）和15.3 mg kg^?1 DW（Tsu-1）之间变化，在硼高效种质中在8.1 mg kg^?1 DW（Kn-0）和16.8 mg kg^?1 DW（S96）之间变化。拟南芥参考种质Col-0的平均地上部硼浓度在硼充足条件下为76.0 mg kg^?1 DW，在缺硼条件下为9.14 mg kg^?1 DW。尽管硼高效种质的平均地上部硼浓度略高，但几个单独的硼高效和硼低效种质在缺硼条件下具有相似的地上部硼浓度，却表现出 contrasting 的缺硼耐受性。例如，硼高效品系Es-0实现了0.54的BEI_shoot，其缺硼地上部硼浓度为11.13 mg kg^?1 DW，而硼低效的Ull2-3具有相似的地上部硼浓度10.52 mg kg^?1 DW，但仅实现了0.03的BEI_shoot，表明Es-0的硼利用效率提高。同时，硼中度高效的Kn-0实现了0.48的BEI_shoot和12.29 mg的地上部DW，其缺硼地上部硼浓度仅为8.13 mg kg^?1 DW，而硼低效的Tsu-1仅实现了0.03的BEI_shoot和2.35 mg的地上部DW，尽管其硼浓度为15.53 mg kg^?1 DW。这表明拟南芥的缺硼耐受性不一定与较高的地上部硼浓度相关。

其他矿质营养元素的地上部浓度在硼高效种质中通常不受缺硼的影响。然而，硼低效种质在缺硼条件下表现出较低的Mg、P、Ca、Mn、Fe和Zn，这可能是根系养分吸收和转运过程普遍下降的结果。许多硼低效种质的地上部K浓度低于硼高效种质，无论是在硼充足（低15.2%，P=0.003）还是缺硼（低24.6%，P<0.001）条件下，这可能表明硼效率存在渗透调节成分。

我们计算了地上部硼含量，以评估植物根系能够吸收并转运到地上的硼量。暴露于缺硼条件下的植株的地上部硼含量在硼高效种质中平均比硼低效种质高6.52倍，这是由于前者的生物量积累更高（P<0.001）。在硼充足条件下，这些组之间的硼含量没有检测到差异。暴露于缺硼条件下的硼高效种质之间的硼含量变化了3.74倍，从53.28（Db-0）到199.11（Cal-0）ng B每株地上部，硼低效种质变化了9.02倍，从4.04（Van-0）到36.46（Tsu-1）ng。硼高效Db-0和硼低效Tsu-1之间相似的硼含量表明，一些种质即使在硼积累量低的情况下也能继续生长，表明具有高硼利用效率。

侧根长度增加可能是对硼限制的适应性响应

为了评估根系性状是否可以作为对缺硼的适应性响应，从而有助于硼积累，我们在培养皿培养系统中测定了185个种质在硼充足和缺硼条件下的根系结构性状。硼转运蛋白突变体nip5;1被包括在内作为质量对照检查，以确认确实诱导了缺硼。正如预期，nip5;1没有植株在移植到缺硼生长条件后显著继续生长。nip5;1和其衍生的种质Col-0之间的直接比较总结在图中。初生根长度（PRL）的变异在硼充足和缺硼生长条件下相似，范围分别变化了3.28倍（从Uk-1的2.88 cm到Oy-0的9.46 cm）和3.65倍（从Hau-0的1.77 cm到Ost-0的6.45 cm）。拟南芥参考种质Col-0在硼充足和缺硼条件下的PRL分别为7.27和3.86 cm。总根长度（TRL）在硼充足条件下在Wag-3（5.87 cm）和Kas-2（20.19 cm）之间变化了3.44倍，在缺硼条件下在Gel-1（3.07 cm）和Ost-0（11.83 cm）之间变化了3.86倍。总侧根长度（TLRL）的变异在缺硼条件下更高，在缺硼条件下变化了29.10倍（从Tamm-2的0.22 cm到Akita的6.35 cm），在硼充足条件下变化了12.53倍（从Wag-3的1.08 cm到Kas-2的13.49 cm）。所有种质的PRL在缺硼条件下都比硼充足条件减少，范围从N13的23.6% PRL减少到Rak-2的76.9%减少。同时，15个种质的TLRL在缺硼条件下高于硼充足条件，范围从缺硼下增加1.32%（Ang-0）到增加68.42%（DraIV6-35），表明可能存在适应性响应。在缺硼条件下，15个种质的平均每株侧根数（LRN）增加，尽管其中只有两个是TLRL增加的种质。38个种质在缺硼条件下也表现出平均侧根长度（ALRL）增加，包括所有15个表现出TLRL增加的种质。最后，侧根密度（LRD）在缺硼条件下通常显示出比硼充足条件下更高的值，这是由于在缺硼条件下PRL的减少通常大于LRN的减少。

为了评估观察到的根系性状是否影响缺硼条件下的地上部硼吸收和积累，我们进行了各自性状之间的相关性分析。根系性状与地上部硼含量之间的相关性通常比根系性状与地上部硼浓度之间的相关性更显著。观察到的最强关系是缺硼条件下的TRL与地上部硼含量之间的关系（Pearson r=0.507，P<0.001）。有趣的是，PRL与地上部硼浓度的相关性最强（Pearson r=0.328，P=0.032），而TLRL与地上部硼含量的相关性更强（Pearson r=0.475，P=0.001）。在缺硼条件下，硼高效种质不一定比硼低效种质具有更高的硼浓度，而所有硼高效种质都比硼低效种质具有更高的硼含量。因此，虽然初生根似乎有助于硼吸收，但侧根对维持旺盛的地上部生长似乎有更大的影响。这可能是由于它们开辟了更大的土壤体积，从中获取恒定的硼供应给发育中的地上部，即使这种供应非常低。我们还评估了缺硼条件下根系性状与地上部性能之间的关系。缺硼与硼充足条件下的PRL比率与BEI_shoot的相关性比侧根相关性状更密切，Pearson r为0.330（P<0.001），而TLRL为0.190（P=0.010），侧根数（LRN）为0.063（在P<0.05时不显著），ALRL为0.152（P=0.040）。然而，硼高效种质可以通过其维持侧根性状的能力更明显地区分：缺硼与硼充足条件下的TLRL比率在硼高效种质中平均比其他所有种质大30.9%，ALRL大22.4%。同时，LRN比率在硼高效种质中仅比硼低效种质高5.92%，表明一旦形成侧根，延长侧根比投资于新的侧根对硼效率更重要。

种质被分配了一个根硼效率指数（BEI_root），其考虑了在缺硼与硼充足生长条件下获得的PRL和TLRL值的比率。平均BEI_root为0.323，范围从0.054（Rak-2）到1.243（DraIV6–35）。拟南芥参考种质Col-0的BEI_root为0.228。与BEI_shoot分数相似，BEI_root分数呈右偏分布，Shapiro-Wilk检验拒绝正态性（P<0.001），表明群体中初生根和侧根生长对硼限制高度敏感的种质富集。我们将BEI_root第90百分位（>0.52）的种质分类为硼高效（19个种质）。五个种质，Cha-0、Eden-1、Tha-1、Hn-0和Yo-0，同时处于BEI_shoot和BEI_root的第90百分位，因此被认为是高度耐缺硼种质。四个种质，Van-0、Kz-1、RLD-2和Gel-1，同时处于BEI_shoot和BEI_root的第10百分位，因此被认为是高度缺硼敏感种质。两个种质，Uod-1和Hovdala-2，处于BEI_root的第90百分位，但处于BEI_shoot的第10百分位。相比之下，没有一个具有最恢复力地上部生物量积累的种质（BEI_shoot第90百分位）具有高度缺硼敏感的根（BEI_root第10百分位），并且除了两个种质（Cal-0和Com-1）外，所有这些种质的TRL都处于前50百分位。这表明具有高地上部性能的种质在缺硼条件下也具有未受严重抑制的根系。虽然培养皿培养系统针对测量根而非地上部响应进行了优化，但我们还测量了在培养皿系统中在硼充足和缺硼条件下生长的所有种质在实验结束时的地上部DW。在缺硼条件下，地上部DW变化了7.50倍，从0.078到0.585 mg每株，在硼充足条件下变化了3.82倍，从0.186到0.710 mg每株。在自动化表型实验中第10天测量的PLA与在培养皿实验中测量的地上部DW之间观察到显著相关性（r=0.284）。选择自动化表型实验中第10天的PLA作为最合适的生物量相关性状，与来自琼脂平板实验的地上部DW进行比较，因为琼脂平板实验的地上部DW是在植株暴露于不同硼条件10天后测量的。虽然大多数种质的地上部生物量相关性状的具体排名在生长系统之间不保守，但几个极端硼高效或缺硼敏感种质在两种生长系统的缺硼条件下 clearly 具有 above 或 below 平均性能，证实了硼效率的变异在这个群体中是稳定的。

具有 contrasting 缺硼耐受性的种质在硼转运蛋白表达或其氨基酸序列上均未显示差异

在选作地上部离子组分析的相同43个种质的幼苗根中测定了三个生理相关硼转运蛋白NIP5;1、NIP6;1和BOR1的转录本丰度。NIP5;1在所有种质中都被缺硼上调，范围从8.25倍到49.98倍上调。参考种质Col-0中的NIP5;1在缺硼条件下被上调22.70倍。硼高效（20.62倍）和硼低效（24.17倍）种质之间的平均上调没有显著差异（P=0.24）。两组都包含具有较高（Kas-2，硼高效，49.98倍；Duk，硼低效，48.59倍）和较低（Ca-0，硼高效，9.76倍；Rld-2，硼低效，8.25倍）上调的种质。NIP6;1对缺硼没有特别差异表达，没有种质表现出大于2倍的上调或下调。BOR1在缺硼条件下平均被上调1.38倍，但在硼高效种质中变化了5.25倍（从0.85到4.46），在硼低效种质中变化了3.56倍（从0.72到2.55）。硼高效和硼低效种质之间的BOR1表达响应没有差异（P=0.98）。未检测到任何三个转运蛋白的表达水平与BEI_shoot之间的显著相关性。此外，这些转运蛋白的根表达水平与缺硼生长条件下的地上部硼浓度或含量不相关，表明其他因素 contribute to 种质间硼浓度的差异。Kas-2，一个硼中度高效种质，在所有种质中对NIP5;1和BOR1在缺硼条件下的上调最高（分别为49.98倍和4.46倍），表明在该种质中可能存在硼转运蛋白驱动的适应性响应。

此外，我们对NIP5;1、NIP6;1和BOR1的编码序列进行了单倍型分析，以测试种质特异性氨基酸序列变异（可能改变硼转运能力）是否与地上部硼含量或BEI_shoot值相关。在所使用的SNP★ar工具中可获得单倍型数