合成抗菌肽VG18与KG18转基因烟草的结构功能解析及抗病原菌应用研究

本刊推荐：本文系统研究合成抗菌肽（AMPs）VR18与KG18的结构功能及其在转基因烟草中的抗病原菌应用。通过核磁共振（NMR）和分子动力学（MD）模拟揭示其与脂多糖（LPS）互作机制，证实其在植物体内稳定表达且不干扰正常代谢，显著增强对 Pseudomonas syringae pv. tabaci 的抗性。该研究为开发可持续农业抗病策略提供新思路，具有重要理论和应用价值。

　　

1 引言

作物病害导致农产品质量和产量显著下降，造成巨大经济损失并加重农民负担。当前防治方法主要依赖化学农药和抗菌剂，对人类健康和环境构成显著风险。美国环境保护署已记录农药暴露相关的不良影响，包括有机磷和氨基甲酸酯引起的神经毒性、皮肤和眼睛刺激、癌症和糖尿病等慢性疾病风险增加、哮喘等呼吸系统疾病、生殖障碍以及阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病。这些慢性疾病通常归因于农药干扰离子通道和酶，破坏细胞稳态。

作为回应，一些发达国家已实施严格的农药登记监管变化，要求有害成分减半，同时促进保留靶向特异性、细胞毒性最小且环保的活性成分。这些法规导致许多农药被禁用，使管理影响经济重要作物的植物病害的努力复杂化。

植物基因工程，包括常规转基因方法以及基因组编辑技术，已成为改善作物健康的有力工具。例如，RNA干扰（RNAi）通过触发双链RNA（dsRNA）介导的病毒RNA降解来破坏病毒生命周期，并已广泛用于培育抗病毒作物，如转基因南瓜和番木瓜，它们已在美国成功种植超过25年。其他方法采用CRISPR-Cas技术，利用Cas核酸酶生成序列特异性核糖核蛋白，靶向并降解病毒DNA或RNA。基于“基因对基因”理论的抗性（R）基因表达也显示出潜力，如辣椒Bs2 R基因在番茄植物中的表达，赋予了对由Xanthomonas sp引起的细菌性斑点病的抗性。尽管有这些进展，这些策略通常受限于其狭窄的微生物谱，强调需要更广泛、更灵活的方法。

抗菌肽（AMPs）一直是生物体先天免疫系统的一部分，从微生物和无脊椎动物到高等植物和动物。它们表现出快速的作用模式以及对细菌、真菌、病毒和寄生虫的广谱活性。与大多数现有抗菌剂相比，AMPs显示出非特化的作用模式，主要扰动带负电的微生物膜。改变微生物膜组成是一个高度耗能的过程。一些AMPs也被报道具有细胞内靶标，如indolicidin，一种靶向细胞质膜并抑制DNA合成的肽。这种多模式的作用机制使得对这些AMPs产生耐药性变得困难，从而为研究AMPs作为应对耐药微生物病原体的下一代武器开辟了新视野。然而，近年来，也有少数关于AMPs耐药性的报道。大多数天然存在的AMPs在较高浓度下也表现出宿主细胞毒性，限制它们仅用于局部应用。因此，使用天然存在AMPs的修饰类似物以及合成设计肽的肽设计策略已获得极大关注，以期开发具有所需特性的新型抗菌剂。

AMPs作为对抗作物病害的潜在候选者已引起巨大兴趣， owing to their versatile biological properties. 植物AMPs主要基于序列相似性、半胱氨酸基序和三级结构进行分类。大多数植物AMPs在生理pH下带正电，分子量范围从2到10 kDa。其中，阳离子AMPs（CAMPs）是研究最多的， owing to their broad-spectrum activity at low concentrations, unique mechanisms of action, and the difficulty of microorganisms to develop resistance against them.

有趣的是，AMPs的结构一直是其功能活性的主要驱动力。一些植物AMPs，如植物防御素和硫素，呈现β-折叠结构，而其他如α-hairpinin家族，则包含两个反平行螺旋。天然植物AMPs通常以基础水平组成型表达，直到被病原体攻击诱导，导致多种AMPs在植物各个部位同时产生和积累。异源AMPs在转基因植物中的表达为开发植物抗病性开辟了有前景的途径。例如，萝卜防御素Rs-AFP2在番茄和烟草植物中已显示赋予对Amantia longipes感染的抗性。然而，尽管它们有前景的治疗潜力，这些天然产物 characterized by a limited spectrum of biological activity and restricted efficacy towards specific targets, demanding further research for expanded utility.

完整AMPs在植物中的表达遇到若干挑战，如易受内源性蛋白水解切割、对植物膜的不利影响以及效力降低。解决这些障碍对于优化农业应用中基于AMPs的策略至关重要。在本研究中，我们采用了一种替代策略，过表达两种合理设计的AMPs，即VR18（VARGWGRKCPLFGKNKSR）和KG18（KNKSRVARGWGRKCPLFG）在Nicotiana tabacum中。这些肽对哺乳动物细胞无细胞毒性，并对多种动物和植物病原体表现出广谱活性。生物物理分析进一步证明，这些肽通过与细菌外膜和内膜脂质成分的相互作用发挥其抗菌作用。重要的是，这些肽不扰动植物模型膜模拟物，并且在含有蛋白酶的植物提取物中稳定。分子生物学和代谢组学研究的结合表明，这些肽在转基因植物中的内源性表达增强了植物的先天防御机制，而不破坏其代谢过程。

2 结果

2.1 肽设计

我们之前设计并表征了合成肽VG16KRKP（VARGWKRKCPLFGKGG），并评估了其对一系列革兰氏阴性细菌病原体的抗菌活性，包括植物和动物相关菌株，以及动物真菌病原体。VG16KRKP表现出广谱抗菌活性，但 notably lacked efficacy against the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive bacteria。使用高分辨率NMR的结构分析，结合突变研究，鉴定出残基W5、L11和F12对生物活性至关重要。这些残基形成了一个疏水中心，对膜相互作用至关重要，任何这些残基的替换都会导致抗真菌效力显著降低或完全丧失。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，是一种内毒素。LPS不仅负责细菌细胞的抗原特性，还有助于细胞膜的结构完整性。它通过稳定细胞膜的外叶并防止几种抗菌剂的渗透，作为细菌细胞的第一道防线。因此，为了增强对P. aeruginosa的活性，我们设计了两种嵌合肽KG18和VR18，通过将截短的VG16KRKP变体（VG13P: WKRKCPLFG）的结构功能域与源自WR17肽的LPS结合基序融合。WR17（WKLLSKAQEKFGKNKSR），一种最初从lactoferrampin序列开发的阳离子抗菌肽，先前被证明能有效与LPS相互作用，破坏其屏障功能。引入这种LPS结合基序（K¹³NKSR¹⁷ of WR17）旨在促进外膜渗透并增强杀菌活性。KG18和VR18都对P. aeruginosa表现出显著改善的抗菌活性，包括浮游和生物膜形式。

2.2 VR18和KG18对植物病原体的效力

我们进一步评估了KG18和VR18对ESKAPE组的动物病原体和几种农业重要植物病原体的抗菌效力，包括Xanthomonas campestris pv. vesicatoria、X. campestris pv. campestris、X. oryzae pv. oryzae和Pseudomonas syringae pv. tabaci。这些病原体已知会严重影响商业重要作物。两种肽都非常有效，完全抑制革兰氏阴性病原体的生长，最小抑制浓度（MIC_99%）范围从3到10 μM。值得注意的是，KG18和VR18的抗菌效力显著大于原始VG16KRKP肽。VR18的半最大抑制浓度（IC₅₀）值范围从1.50到4.25 μM，而KG18的范围从2.75到5.50 μM。

为了评估膜完整性以及肽与植物病原体P. syringae pv. tabaci相互作用的潜在机制，我们采用了膜不透性核酸染料碘化丙啶（PI）。在生理条件下，两种AMPs，KG18和VR18，引起P. syringae膜破坏，表现为PI荧光强度增加。KG18表现出更强的效果，导致约75%的PI摄取，而VR18仅显示40%摄取。阳性对照多粘菌素B（PMB）显示最大PI摄取。总的来说，这些结果表明KG18是比VR18更有效的P. syringae膜破坏剂。

2.3 VR18和KG18的细胞活力、过敏原性和稳定性

接下来，我们评估了VR18和KG18对人胚胎肾（HEK 293）细胞系的细胞毒性作用；两种肽即使在高达4× MIC_99%的浓度下也表现出无毒性。我们评估了蛋白质/肽产生过敏原性的可预测性，根据WHO和FAO指南。使用AlgPred服务器，它使用支持向量机（SVM）算法，我们发现两种AMPs都是非过敏性的。此外，使用ADMET-AI服务器分析了VR18和KG18的ADMET特性。机器学习（ML）预测表明，两种肽都是无毒的，表现出低口服吸收，不穿过血脑屏障，并且对hERG通道无毒。

此外，我们还研究了VR18和KG18在含有活性植物蛋白酶的烟草植物提取物中的稳定性。VR18显示出超过120分钟的半衰期，而KG18的半衰期超过60分钟。总之，这些发现清楚地表明，这些肽是无毒、非过敏性的，并且在植物蛋白酶存在下稳定，突出了它们作为抗菌剂开发的潜力，特别是在农业应用中。

2.4 VR18和KG18与P. syringae在原子水平相互作用的映射

由于两种肽VR18和KG18都表现出对P. syringae的抗菌活性，我们旨在使用溶液态活细胞NMR光谱进一步研究其与细菌细胞在原子分辨率下的分子相互作用。为了实现这一点，我们采用了饱和转移双差（STDD）NMR来映射参与与活细胞相互作用的关键肽残基。VR18的STDD信号主要针对残基W5和F12的芳香环质子以及V1和L11的γ-和δ-甲基质子。这些发现表明，这些特定残基在膜结合和与细胞表面相互作用中发挥直接和积极的作用。

相比之下，W10和F17的芳香环质子，以及V6和L16的γ-和δ-甲基质子，表现出最强的STD信号。这表明这些疏水残基位于细菌细胞表面附近。此外，从Arg和Lys残基（K1/K3/R5/R8/R12/R13）的β-、γ-和δ-质子观察到中等STD信号，表明这些带正电的残基靠近细菌表面。还检测到P10、A7的β-质子以及某些芳香残基的弱STD峰，表明在相互作用中的次要参与。

2.5 AMP对P. syringae细胞效应的可视化

接下来，我们使用扫描电子显微镜（SEM）可视化了肽对P. syringae细胞的影响。在没有肽的情况下，细菌细胞保持完整并保持 distinct rod-shaped morphology。然而，用两种肽在0.5× MIC_99%浓度处理细胞导致细胞显著聚集，表明应激诱导反应，以及总体细菌细胞数量减少。引人注目的是，在较高浓度（1×和2× MIC_99%）下，细胞完全破坏，没有可区分的细胞形态，裂解后观察到细胞碎片残留。为了进一步探究肽对膜表面的影响，我们进行了高分辨率固态原子力显微镜（AFM）。结果显示，在1× MIC_99%和2× MIC_99%肽浓度下，细胞急剧收缩并伴有膜起泡。此外，我们观察到显著的表面扭曲、不可逆损伤、 fragmentation以及细菌细胞内含物的释放。总的来说，这些显微技术揭示了肽的溶菌效应。

2.6 表达VR18和KG18肽的转基因植物的开发

我们进行了农杆菌介导的转化，使用pCAMBIA 1304表达载体， resulting in the generation of five primary transgenic lines of Nicotiana tabacum, each expressing the VR18 and KG18 genes from five different callus cultures。这些转基因系通过T₁代维持，基于潮霉素抗性进行选择。值得注意的是，转基因植物在表型上与温室中生长的野生型植物无法区分。

使用RT-PCR确认了T₁转基因植物中VR18和KG18转录本的表达。三个不同的系表现出VR18转基因的表达，由88 bp扩增子指示，而KG18转基因的表达在四个转基因系中检测到，由113 bp扩增子证明。这些转基因系进一步维持到T₂代用于后续研究。相比之下，从对照植物样品或载体对照植物中未扩增出肽特异性RNA产物。然而，在所有测试样品中可检测到看家EF1α基因的表达。此外，我们还使用MALDI分析测试了这些肽在转基因植物中的翻译。来自转基因植物的植物提取物的质谱在m/z范围2063 Da和2066 Da处显示显著峰，分别对应于VR18和KG18的分子量。在来自载体对照植物的植物提取物质谱中未观察到此类峰。

2.7 VR18和KG18转基因植物对植物病原体表现出强抗性

我们通过用P. syringae pv. tabaci挑战野生型和转基因植物来评估肽的体内活性。假单胞菌感染的野生型和载体对照叶子在72小时内在整个叶表面发展出许多小棕色斑点，并且在某些情况下，感染部位周围也出现褪绿晕。感染96小时后，我们观察到对照植物叶子明显褪绿和完全萎蔫，导致生长受阻伴随 prolonged infection。相比之下，VR18转基因植物仅在一些叶子中显示少数小棕色斑点，并且在感染后96小时，未观察到疾病症状的进一步进展，植物整体健康保持完整。值得注意的是，即使在感染后96小时，KG18转基因植物中也没有可见的疾病症状。病变面积的定量评估显示，疾病进展显著减少，VR18和KG18转基因叶子分别减少96%和99%。这些发现强烈表明，两种VR18和KG18肽表现出生物活性，有效抑制了疾病发生，通过抑制病原体入侵N. tabacum。此外，我们量化了感染后96小时载体对照植物和转基因植物叶子提取物中P. syringae的菌落形成单位。细菌CFU计数清楚地显示，与载体对照植物相比，转基因植物的CFU减少了85%–90%。

我们还评估了所研究的三个不同系中不同水平的VR18和KG18表达对感染后CFU计数的影响。有趣的是，尽管VR18的表达在系1中高于其他两个系，但所有三个VR18表达系中的CFU计数相似。这表明，在所有系中，肽的组成型生产 above the threshold level to inhibit the infection of P. syringae。在KG18表达植物中获得了类似的结果。KG18表达在系2中略高于其他两个系。然而，三个系之间CFU计数的差异可忽略不计。

2.8 P. syringae感染转基因植物中的ROS积累

植物病原体感染会破坏ROS平衡，导致ROS水平升高，抑制细胞维持 redox equilibrium的能力。为了评估转基因植物在P. syringae攻击后的ROS生成，我们使用组织化学染色方法监测超氧化物（O₂^?）和过氧化氢（H₂O₂）的生成，这些是ROS的主要组成部分 alongside hydroxyl ions。正如预期，感染的载体对照叶子在硝基蓝四唑（NBT）染色后显示蓝色，表明在O₂^?生成部位产生了二甲臜。然而，感染后转基因植物叶子中未观察到此类颜色变化。

我们进一步利用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）的叶子染色 assay，它通过H₂O₂介导的聚合形成棕色沉淀。与我们之前的发现一致，在感染的载体对照叶子中观察到广泛的棕色染色，而在感染的转基因叶子中未检测到棕色染色。总之，这些结果表明转基因植物有效管理ROS水平以应对病原体挑战。

2.9 感染期间AMP转基因植物中应激基因的表达保持不变

植物健康生长 significantly affected by the abiotic and biotic stresses they encounter in their natural environments。为了评估VR18和KG18表达对植物健康的影响，我们测量了两个标志基因的表达水平：ABA2，它催化脱落酸生物合成的最后一步，并作为非生物应激反应的指标；和PR1a，一种 pathogenesis-related gene indicative of biotic stress response，在表达每种肽的三个不同转基因系中。我们的结果表明，与载体对照植物相比，所有三个转基因系中ABA2表达略有但统计上不显著的上调。相反，PR1a基因表达在所有转基因系中表现出轻微下调，与VR18系相比，KG18表达系中下调更明显。为了进一步评估植物的反应，我们分析了使用从感染部位远端的对照和感染叶子提取的总RNA的ABA2和PR1a基因的相对表达水平。在载体对照叶子中，我们注意到ABA2和PR1a表达水平显著上调。有趣的是，在病原体感染后，两个转基因系中的ABA2表达水平保持不变。此外，PR1a表达在两种转基因植物中持续较低；虽然在VR18表达植物中有轻微上调，但这种变化在KG18表达系中不显著。然而，在感染期间，两种转基因系中的PR1a表达至少下调8倍 compared to control plants。这些观察结果与感染研究结果一致，其中VR18表达植物显示一些症状发展，而KG18植物则没有。

2.10 肽表达对烟草次生代谢谱的影响最小

尽管VR18或KG18肽的内在表达导致烟草植物中可忽略的非生物和生物应激反应，但检查这些肽对植物细胞代谢物调节的影响是必要的，因为它们不是植物防御系统的天然组成部分。为了研究这一点，我们采用液相色谱质谱（LC/MS）分析与N. tabacum中VR18和KG18肽表达相关的代谢变化。基于LC/MS的m/z比和保留时间，共鉴定出362种代谢物。

我们生成了两个火山图，比较对照组和KG18植物之间的代谢物谱，以及对照组和VR18植物之间的代谢物谱。我们的分析显示，与对照组相比，表达VR18和/或KG18的植物中筛选的代谢物没有显著上调或下调。然而，在p值阈值大于0.05时，我们观察到某些m/z~121且保留时间不同的化合物在KG18表达植物中显著上调， fold change greater than 2。这些上调的代谢物主要被鉴定为多酚，包括3-羟基苯甲酸、原儿茶醛和4-羟基苯甲醛等。这些酚类化合物 recognized for their antioxidant and antimicrobial properties。

另一方面，我们发现KG18表达植物中萜类组的代谢物（m/z~153；保留时间3.88分钟）下调。在对照和VR18表达转基因植物的比较中，未观察到相对代谢物表达的变化。总的来说，代谢组分析表明，外源VR18和KG18的转基因表达没有显著影响植物代谢或生物活性天然化合物的生产。总之，这些结果表明这些肽的转基因表达可能主要通过肽介导的病原体膜破坏赋予病原体抗性，而不是通过代谢途径的显著变化。

2.11 AMPs与细菌脂多糖的相互作用

为了研究肽VR18和KG18与脂多糖（LPS）的结合相互作用，革兰氏阴性细菌外膜的关键成分，我们利用荧光光谱，探索两种肽中存在的Trp残基。值得注意的是，AMP必须先与LPS相互作用，然后才能进入内膜。据推测，AMPs通常与较大的LPS胶束聚集体相互作用并导致碎片化， adopting secondary conformations。随着LPS浓度增加滴定，VR18和KG18的发射最大值（λ_max）分别从~350 nm移动到364和365 nm。为了进一步分析LPS对肽中Trp残基旋转自由度的 impact，我们应用了荧光各向异性实验。LPS存在下的各向异性程度使我们能够计算平衡解离常数（K_D），分别确定为VR18为0.31 ± 0.02和KG18为0.31 ± 0.09 μM。

此外，我们采用等温滴定 calorimetry（ITC）实验来测量两种LPS活性肽的结合能。结果表明，结合反应是自发的并由熵驱动，产生解离常数（K_D）分别为VR18和KG18为0.70和0.40 μM，这与荧光技术的结果 well correlated。这些分析提供了这些肽对LPS强亲和力的 insights，突出了它们在破坏细菌膜中的潜在作用。

LPS胶束的动态光散射（DLS）测量表明，增加VR18和KG18浓度导致LPS胶束组织立即改变。这 evidenced by a faster relaxation decay and decrease in delay time。因此，我们观察到多分散指数（PDI）从0.22下降到VR18的0.20和KG18的0.17，表明添加肽后LPS聚集体的尺寸分布变窄。LPS胶束的平均流体动力学直径从250 nm下降到VR18的119 nm和KG18的114 nm。

为了在原子分辨率下进一步研究LPS聚集体破坏的机制，我们对LPS单独以及在增加KG18浓度存在下进行了一维³¹P溶液态NMR实验，使用MnCl₂作为顺磁淬灭剂。在这些实验中，单独LPS的³¹P峰在MnCl₂存在下受影响最小。然而， upon addition of increasing concentrations of both peptides, these peaks were completely quenched, confirming that the phosphate head groups were completely exposed to the Mn²⁺ ions。此外，在KG18和VR18存在下，LPS的一维¹H NMR谱显示浓度依赖的线宽化和LPS酰基链的化学位移扰动。总之，DLS和³¹P NMR实验的结果表明，VR18和KG18与LPS相互作用并通过 detergent-like mechanism破坏其结构，导致LPS聚集体的碎片化。

2.12 AMPs与膜模型模拟物的相互作用

氨基酸Arg（R）和Lys（K）的pK_a值分别为12.48和10.53，表明设计的AMPs的电荷在pH 5到8范围内保持恒定。这种净正电荷增强了肽与微生物膜相互作用的能力。P. syringae的毒力与其通过伤口或气孔进入并在酸性质外体中增殖有关，该环境由生长素诱导的质子泵维持。为了评估这些肽对由7:3 POPE/POPG组成的革兰氏阴性细菌外膜模型模拟物的活性，我们采用了基于荧光的钙黄绿素染料泄漏实验，在pH范围从5.4到8.0。发现VR18和KG18都与膜模拟物相互作用，导致钙黄绿素荧光强度分别增加80%和75%。相比之下，这些肽在由5:4:3 POPC/POPE/STG组成的植物膜模型模拟系统中不能引起任何此类泄漏。此外，VR18和KG18在细菌内膜模型模拟物（3:1 POPE/POPG）中在生理pH下表现出浓度依赖的染料泄漏。为了进一步评估这些肽的特异性，我们测试了两种成熟的AMPs，多粘菌素B和蜂毒肽，它们与植物模型膜模拟物的相互作用。我们的结果表明，与KG18和VR18相比，多粘菌素B和蜂毒肽引起模型膜的显著扰动。总之，这些发现暗示了VR18和KG18对细菌模型膜的特异性选择性。

接下来，为了评估VR18和KG18与各种膜模型模拟物的结合能力，我们将肽VR18和KG18与LPS双分子层以及由7:3 POPE/POPG、3:1 POPE/POPG和5:4:3 POPC/POPE/STG组成的模型膜分别孵育。下拉 assay followed by SDS-PAGE analysis revealed that more than 50% of both VR18 and KG18 preferentially bound to LPS bicelles and the bacterial membrane model liposomes。肽与LPS双分子层和细菌模型膜脂质体的结合和未结合部分的比例约为1:1，表明快速相互作用；然而，在未结合部分也检测到显著部分的肽。然而，对于植物膜模拟物5:4:3 POPC/POPE/STG脂质体，两种肽VR18和KG18的结合与未结合比例分别约为1:3和1:3.5，表明大多数肽在此模型中保持未结合。

为了进一步探索AMPs的选择性膜扰动，我们进行了³¹P固态NMR光谱以及使用细菌（7:3 POPE/POPG）和植物（5:4:3 POPC/POPE/STG）模型膜模拟物的谱形分析。两种模型膜都显示出粉末图案，平行边缘在~30 ppm，垂直边缘在15 ppm附近。在添加1和3 mol%浓度的肽后，我们观察到细菌外膜模型模拟物的瞬时变化。在平行和垂直边缘观察到的改变表明脂质分布均匀性受到干扰， resulting from peptide-lipid interactions。在细菌内膜模型模拟物中注意到类似的变化。相比之下，将VR18和KG18添加到植物膜模拟物5:4:3 POPC/POPE/STG脂质体中未导致任何光谱变化，表明脂质体完整性得以维持。这些发现表明了VR18和KG18带负电微生物膜 perturbing capability以及 stigmasterol提供给植物膜模型模拟物的稳定性。

2.13 VR18和KG18的生物活性构象

我们使用溶液态NMR光谱研究了VR18和KG18在P. aeruginosa LPS双分子层存在下的3D结构。胶束和双分子层为高分辨率NMR提供了最佳环境，因为双分子层形成双层，允许肽采用类天然构象。在pH 4.0添加2 μL LPS双分子层后，VR18和KG18的一维质子NMR谱表现出显著的线宽化。这种情况有利于trNOESY实验，允许确定肽在LPS存在下的3D结构，因为它们与结合的大分子在NMR时间尺度上经历快速到中间交换。游离肽仅显示某些 intra-αN (i,i) or sequential αN (i, i+1) NOEs， suggesting a highly dynamic nature。然而，在双分子层存在下，在KG18的大部分残基和VR18的所有残基（除了P10）中观察到强的αN (i, i+1)和HN/HN NOEs，表明从随机卷曲转变为明确折叠构象。LPS结合的VR18和KG18的谱分析还揭示了几个 medium (i, i+2/i+3/i+4), side chain/side chain, and long-range (i to ≥ i+5) NOEs。引人注目的是，在VR18的情况下，W5的吲哚环质子（N^εH），在10.17 ppm共振，显示与V1、A2、L11和F12的脂肪族质子接触。几个质子参与建立重要的长程NOE接触，如与W5H4/W5H7/W5H2/W5H5，像L11CδH、F12βH等。在V1/W5、A2/W5和P10/F12之间注意到侧链/侧链中程NOEs。KG18的W10的N