基于聚联噻吩的电聚合分子印迹聚合物用于蛋白质检测：电化学信号转导策略的比较机理研究

本综述系统比较了电聚合分子印迹聚合物（e-MIP）平台中差分脉冲伏安法（DPV）和电化学阻抗谱（EIS）两种信号转导策略，以胱抑素C（Cys-C）为模型蛋白。研究通过分子对接筛选最优功能单体，优化电聚合条件，并证实DPV凭借其电容电流抑制能力和更高的信噪比，在检测限（LOD: 0.19 μg mL?1）、定量限（LOQ: 0.64 μg mL?1）及线性范围（0.1–3.0 μg mL?1，R2 = 0.99）上均优于EIS，为蛋白质生物传感提供了关键的机理见解和策略选择依据。

　　

引言

蛋白质识别是生物标志物诊断中最常见的应用之一。当前的方法主要依赖于抗体等生物识别元件，虽具有高特异性和选择性，但面临生产成本高、储存不稳定、批次间差异及环境敏感性等挑战。分子印迹聚合物（MIPs）作为“塑料抗体”，提供了与生物受体相当的选择性和特异性，同时具备成本效益高、易于定制和生产、物理与环境稳定性好、可扩展性强及保质期长等优势，是极具前景的替代品。MIPs通常通过在模板分子周围聚合功能性单体和交联剂形成，随后移除模板以产生特异性结合空腔。其合成方法主要分为一锅法聚合（如本体、沉淀、乳液聚合）和表面印迹技术（如核壳接枝、固相印迹、电聚合）。在生物传感器开发中，本体聚合、核壳印迹和电聚合是最常用的技术。电聚合是一种表面印迹技术，可直接在导电基底（如金、铂）表面合成纳米厚度的MIP层，并能通过多种电化学模式（如恒电位、动电位技术）进行原位监测和实时控制薄膜生长。尽管已有许多成功的e-MIP生物传感器被开发出来，用于检测从心血管疾病到癌症和传染病的多种蛋白质标志物，但针对相同平台上不同电化学检测策略（如EIS和DPV）的系统性比较研究仍然匮乏，这限制了对特定应用最佳转换方法的理解。本研究旨在填补这一知识空白。

分子对接模拟与MIP组分选择

目标分析物（或模板蛋白）与功能单体之间相互作用的强度和模式决定了分子识别事件的有效性，直接影响生物传感器的分析性能。因此，选择能与目标蛋白有效相互作用的合适功能单体，对于开发性能与生物受体诊断平台相当的MIP生物传感器至关重要。本研究通过分子对接模拟评估了Cys-C与三种不同电活性单体：2,2′-联噻吩-5-羧酸（BTP-BCA）、邻苯二胺和3-氨基苯酚在水环境中的相互作用。BTP-BCA表现出最优的结合特性，其结合自由能为-19.5 ± 0.8 kcal mol^?1，拥有四种不同的结合姿势，其结合能优于其他电活性候选单体，且标准偏差最低，表明其结合自由能预测最为一致。BTP-BCA的优异性能归因于其平衡的分子结构，使其能够实现多种互补的相互作用机制：电活性噻吩部分 enable 可控聚合，羧酸功能团在生理条件下（pH 7.4）与带正电的Cys-C区域（pI ≈ 9）提供静电相互作用，同时联噻吩骨架与芳香族氨基酸残基（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）提供疏水相互作用和π-π堆积。这有助于预聚合阶段的单体-蛋白质相互作用及后续分析物识别阶段，从而提高识别位点的特异性和结合稳定性。基于此，选择2,2′-联噻吩（BTP）作为交联剂，主要基于三个因素：其与BTP-BCA的联噻吩骨架结构相似，确保了优异的化学相容性，促进电聚合过程中的均匀共聚；BTP中噻吩单元的电活性 enable 可控聚合，增强MIP网络的结构完整性；其二聚体结构相较于噻吩单体增强了网络稳定性，同时为模板移除后保持印迹空腔结构提供了最佳交联密度。

电聚合分子印迹聚合物（e-MIP）的合成

电聚合可以轻松控制薄膜厚度和形态，并具有高重现性，其薄膜厚度由电聚合过程中转移的电荷量决定，与电极几何形状无关。电聚合条件和单体-交联剂浓度比的选择基于全面的优化研究。这些研究使用了90对溅射在玻璃基底上的5 μm金叉指电极（IDEs），间隙为5 μm。电聚合采用三电极系统，包括金工作电极（Au-WE）、铂丝对电极（Pt-CE）和银/氯化银参比电极（Ag/AgCl-RE）。循环伏安（CV）分析确定了BTP氧化电位窗口在1.5至1.7 V之间。随后的恒电位筛选表明，1.6 V为均匀网络形成提供了最佳条件，在此电压下完全交联可防止过氧化效应，形成致密的交联网络层。其次，研究了功能单体-交联剂（BTP-BCA:BTP）摩尔比（1:4, 1:8, 1:10）和聚合电位（1.5, 1.6, 1.7 V，持续60秒）对在IDEs上形成的电聚合非印迹聚合物（e-NIP）层电化学性能的影响。在e-NIP/IDEs的电聚合过程中，观察到凝胶形成作为一种副反应，这是在羧酸基团存在下能量输入时已知会发生的现象。因此，选择单体-交联剂摩尔比为1:10作为最佳溶液参数，以避免聚合物网络微观结构的不均匀性。优化研究被认为可跨电极几何形状（叉指电极与单电极）转移，因为两个系统都使用Au-WE、Pt-CE和Ag/AgCl-RE。本研究中进一步e-MIP合成的最终优化溶液和工艺参数定义为：BTP-BCA:BTP摩尔比1:10，通过恒电位沉积在1.6 V下进行60秒电聚合。

物理化学表面表征

e-MIP薄膜作为金单电极（SE）表面的合成受体，其微观结构分析对于建立结构-性能-效能关系至关重要，因为EIS和DPV电化学技术都对影响电荷转移动力学和氧化还原探针可及性的表面特征敏感。通过共聚焦显微镜（CM）和扫描电子显微镜（SEM）分析评估了Cys-C印迹的e-MIP和无Cys-C的e-NIP薄膜的微观结构变化。实验设计涉及两个关键比较：洗涤前后的e-MIP薄膜以评估蛋白质提取和空腔形成的有效性，以及经历相同洗涤处理的e-NIP薄膜以评估尿素洗涤程序对聚合物薄膜结构的非特异性影响。CM分析表明，e-MIP薄膜在模板移除后发生了显著的结构变化，平均高度从5.36 μm降至2.49 μm（Δ = -2.87 μm），证实了模板分子从聚合物基质中的大量提取。同时，表面粗糙度增加，RMS高度（S_q）从0.92 μm升至1.04 μm（Δ = +0.12 μm），与空腔形成一致。相应的SEM图像清晰显示向更 porous 网络结构的转变，表明洗涤后模板成功从e-MIP网络中移除。相比之下，e-NIP薄膜表现出相反的行为，平均高度减少微小（Δ = -0.60 μm），但表面粗糙度增加更为明显（Δ = +0.30 μm）。e-NIP相较于e-MIP薄膜在洗涤后更大的粗糙度增量可归因于洗涤过程中的聚合物溶胀效应，这在没有模板空腔的情况下产生了表面不规则性。e-NIP最初更光滑的形态在洗涤后变得更为不规则，但仍缺乏成功分子印迹特征的有序空腔结构。不同的初始薄膜厚度可能反映了蛋白质存在对聚合物网络形成动力学的影响。e-MIP薄膜洗涤后显著的厚度减少（2.87 μm对比e-NIP的0.60 μm）为有效模板提取提供了定量证据。虽然两种薄膜类型在洗涤后都表现出表面粗糙度增加，但e-MIP薄膜的中度增加（0.12 μm）对比e-NIP薄膜（0.30 μm）表明形成了有序的结合空腔，而非由聚合物溶胀或其他效应引起的随机表面不规则。这些形态变化证实了成功的MIP合成和有效的模板移除，为后续电化学表征研究奠定了基础。

此外，衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析用于深入了解e-MIP薄膜洗涤后表面官能团的变化。O-H/N-H伸缩（3200–3600 cm^?1）区域的宽吸收带在洗涤后强度明显降低，这归因于Cys-C蛋白质的移除，该蛋白质由其氨基酸残基（特别是赖氨酸和精氨酸）贡献了N-H伸缩振动。洗涤后该区域的剩余强度反映了洗涤过程中羟基基团的存在以及可能的一些吸附水分子，与羧酸功能化聚合物网络的亲水性一致。此外，与蛋白质二级结构（酰胺I）相关的C=O伸缩在1640 cm^?1处消失，证实了氢键的缺失，从而表明模板蛋白质已被移除。与模板相关的变化相反，几个关键峰持续存在，证实了模板移除过程的选择性。芳族C-H伸缩振动在2940 cm^?1处持续均匀存在，表明电活性聚联噻吩骨架的结构完整性。新形成的芳族C=C伸缩峰在1607 cm^?1处，表明模板移除后聚合物网络重组，导致空腔形成，暗示聚合物网络内π-π共轭改善。此外，略微改变但保留的聚合物骨架C-H伸缩带（2800–3000 cm^?1）证实模板提取成功且未对聚合物基质造成结构损伤，验证了尿素洗涤方案的有效性。连同指纹区域（1500–600 cm^?1）显示的聚联噻吩结构特征峰，光谱和形态证据证实了成功的分子印迹和模板移除，为后续电化学研究奠定了基础。

分析检测性能：EIS与DPV对比

人Cys-C对早期急性肾损伤（AKI）具有高诊断准确性，报告的尿Cys-C临界值为0.4 μg mL^?1，血清Cys-C为1.0 μg mL^?1。研究重点评估e-MIP/SE和e-NIP/SE在含有5 mM [Fe(CN)₆]^3?/4?氧化还原探针和1 M KCl支持电解质的生理缓冲液（pH:7.4）中检测0.1至3.0 μg mL^?1（包括c = 0空白测量）范围内Cys-C的能力。选择此明确氧化还原系统是为了在受控环境中机械比较DPV和EIS响应。

确定最佳孵育时间对于最大化蛋白质-受体相互作用效率至关重要。因此，进行了开路电位（OCP）测量以确定0.5 μg mL^?1 Cys-C与e-MIP/SE相互作用获得最高信噪比的最佳孵育时间。OCP在前200秒内迅速增加，随后达到稳定平台，表明界面重组和分析物结合在10分钟内达到平衡。通过DPV分析的时间依赖性归一化氧化峰电流|I_{peak, t}|进一步证实了这一点，信号稳步增加并在约10分钟达到峰值，之后下降，特别是在20分钟后，蒸发效应干扰了分析物扩散和信号可靠性。基于信号稳定化和电流响应行为，选择10分钟孵育时间进行后续电化学分析。

DPV是一种高灵敏度的电分析技术，用于检测电活性物种和研究修饰电极界面上的电子转移反应。它通过向工作电极施加阶梯电压波形，并叠加小幅矩形脉冲工作。电流在每个脉冲前后立即测量两次，记录差值。这种差分测量抑制了电容（非法拉第）电流，并放大了由氧化还原反应产生的法拉第信号，产生具有特征峰形信号的伏安图。在MIP生物传感器中，峰值电流响应（I_peak）提供了分析物与生物传感器表面相互作用的定量测量。对于e-MIP传感器，DPV直接监测蛋白质在印迹聚合物网络内的结合如何影响氧化还原探针到达电极表面的通道。DPV结果显示，e-MIP/SE的I_peak随着Cys-C浓度的增加而明显增加，这种峰电流的逐步增加表明Cys-C的存在以促进氧化还原探针电子转移的方式改变了聚合物e-MIP网络的电化学环境。虽然这种趋势与通常报道的MIP平台中电流抑制行为相反，但可以通过静电和导电聚合物相关效应来解释。相比之下，e-NIP/SE的DPV响应显示微小变化，多个伏安图重叠，表明信号产生不一致。e-MIP/SE和e-NIP/SE之间电流响应趋势的差异表明e-MIP/SE表现出蛋白质响应行为，而e-NIP/SE对照在相同实验条件下没有显示出一致的响应。为了进一步评估e-MIP/SE和e-NIP/SE的信号行为，提取了相应Cys-C浓度测量的I_peak数据，并使用公式|I_peak| = |ΔI_peak/I_{peak, blank}|计算了归一化电流|I_peak|，其中I_{peak, blank}代表空白溶液（c = 0）测量的峰值电流。e-NIP/SE的|I_peak|数据表现出几乎平坦的响应（R² = 0.02），所有浓度变化极小。相反，e-MIP/SE的|I_peak|随着Cys-C浓度的增加呈显著线性增加（R² = 0.98），证实了持续且浓度依赖的电化学响应。信号响应模式的显著差异，在大多数浓度下信号比超过两倍，表明e-MIP/SE产生蛋白质特异性信号。

EIS是一种强大且无标记的技术，用于分析固-液界面的电化学特性。在MIP生物传感器中，EIS能够研究发生在固体电极和包含目标分析物的周围电解质溶液之间的电荷转移动力学和界面现象。EIS数据通常使用等效电路（EC）模型解释，该模型使用电阻器和电容器等电路元件模拟电极-电解质界面。最常用的模型之一是Randles等效电路，它由溶液电阻（R_s）与双电层电容（C_dl）和电荷转移电阻（R_ct）的并联组合串联，再与代表扩散控制过程的Warburg阻抗（Z_w）串联组成。在这些组件中，R_ct是MIP生物传感研究最相关的电路元件，因为它暗示了氧化还原探针与MIP修饰电极表面之间的电子转移动力学。当目标分析物（如Cys-C）结合到聚合物基质内的印迹空腔时，它形成电子转移的物理屏障，R_ct值通常增加。因此，浓度依赖的R_ct增加可作为目标分析物结合的直接指标。阻抗数据以奈奎斯特图形式呈现，其中阻抗实部（Z_real）绘于x轴，虚部（Z_imag）绘于y轴。每个数据点对应给定频率下的系统阻抗。奈奎斯特图中常见的半圆形状反映电荷转移过程，半圆直径与R_ct直接成正比。该参数是评估界面电子转移特性及Cys-C结合对e-MIP/e-NIP修饰SEs影响的关键指标。e-MIP/SE和e-NIP/SE都表现出典型的半圆形奈奎斯特图，指示电荷转移行为。对于e-MIP/SE，观察到明显趋势：半圆直径随着Cys-C浓度的增加而减小，表明Cys-C的存在对电子转移动力学有积极贡献。相比之下，e-NIP/SE在所有浓度下显示极小的阻抗变化，没有一致趋势，表明e-MIP/SE观察到的阻抗变化与印迹识别层和Cys-C之间发生的特定分子相互作用相关。为了进一步分析，使用ZView软件将EIS谱拟合到修改的Randles EC模型，并提取了关键电路元件的数值。拟合过程产生了低卡方（χ²）值，约为10^?4，表明高质量拟合。实验和拟合曲线之间的紧密重叠，结合通常低于10%的相对误差，证实了所选EC模型的可靠性和稳健性。为了直接比较e-MIP/SE和e-NIP/SE之间的信号趋势，将R_ct值归一化|R_ct|（|R_ct| = |ΔR_ct/R_{ct, blank}|），其中R_{ct, blank}代表无Cys-C（c = 0）时的电阻。这种归一化补偿了基线变异性，使得能够统一评估浓度依赖的信号变化。e-MIP/SE表现出浓度依赖的减少，具有强线性相关性（R² = 0.80），表明对增加Cys-C浓度的系统阻抗响应。相比之下，e-NIP/SE表现出分散数据，相关性差（R² = 0.26），没有明显的浓度依赖趋势。信号模式的显著差异，两个系统之间标准偏差重叠极小，表明浓度敏感的阻抗行为特定于蛋白质印迹聚合物网络。换句话说，该行为表明Cys-C在e-MIP空腔内的结合通过特定的蛋白质-聚合物相互作用增强了电荷转移电阻。相比之下，e-NIP网络中识别位点的缺失导致不一致的响应。所有测试浓度中一致的响应差异为成功的分子印迹和蛋白质特异性识别及信号生成提供了证据。

Cys-C浓度与e-MIP/SE的R_ct之间的反比关系，虽然与另一项MIP研究的结果一致，但与一些MIP系统中更常报道的正比关系形成对比。该行为可以通过空腔内蛋白质吸附导致的表面电荷分布变化来解释。在中性pH下，Cys-C带正电（pI ≈ 9），可以吸引带负电的氧化还原离子，从而增强它们对MIP修饰电极表面的可及性并促进电荷转移。此外，Cys-C与聚合物MIP网络之间的相互作用可能影响界面离子迁移率和局部电导率。该效应得到π-共轭聚联噻吩骨架固有掺杂能力的支持，该骨架在蛋白质结合时可以进行局部再掺杂或电荷重新分布。这些相互作用可能增加移动电荷载流子的密度并促进薄膜内的反离子通量，进一步促进电子转移。总体而言，尽管此处观察到的R_ct与Cys-C浓度之间的反比关系在MIP生物传感器文献中不常见，但这些发现表明e-MIP/SE以浓度依赖的方式响应Cys-C的存在，与e-NIP/SE观察到的非特异性响应形成对比。

分析性能比较

e-MIP/SE和e-NIP/SE之间的直接比较证明e-MIP/SE在两种检测方法中具有一致的蛋白质响应行为。尽管由于重复有限（n = 3）未进行统计显著性检验，但响应差异的幅度和一致性，e-MIP/SE在多个浓度下显示信号比e-NIP/SE高100%以上，证明了成功的分子印迹和蛋白质特异性识别。这些结果证实了e-MIP/SE作为蛋白质传感平台的有效性，通过Cys-C的电化学检测提供了概念验证。尽管如此，信号强度与目标分析物浓度之间的相关性对于评估e-MIP/SE平台用于Cys-C检测的分析性能特征至关重要。因此，将R_ct和I_peak数据对变化的Cys-C浓度绘制图表，以得出校准曲线并分别计算EIS和DPV测量的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。

两种技术在测试范围（0.1–3.0 μg mL^?1）内对e-MIP/SEs都表现出浓度依赖的信号响应。EIS校准图显示两个不同的线性区域。从较低浓度范围切换到较高浓度范围（从0.0–0.5到0.5–3.0 μg mL^?1），校准曲线的斜率从-29 kΩ μg^?1 mL（R² = 0.73）急剧下降到-1.9 kΩ μg^?1 mL（R² = 0.94）。相应的LOD和LOQ值对于较低浓度范围（0.0–0.5 μg mL^?1）分别计算为0.53和1.78 μg mL^?1，对于较高浓度范围（0.5–3.0 μg mL^?1）分别计算为0.99和3.31 μg mL^?1。EIS测量的相对标准偏差（RSD）显示出良好的重现性，RSD值从基线的0.51改善到3.0 μg mL^?1时的0.11，证明在较高浓度下具有优异的精密度。EIS校准曲线中观察到的双相行为可归因于低与高蛋白质浓度下的不同结合机制。在浓度低于0.5 μg mL^?1时，蛋白质结合主要发生在高亲和力印迹空腔内，导致电阻急剧变化。高于0.5 μg mL^?1时，主要结合位点饱和导致较弱的次级相互作用，产生更渐进的响应斜率。

相比之下，DPV校准图在整个浓度范围内表现出单一、强线性响应，更陡的斜率为0.38 μA μg mL^?1，且线性相关性高（R² = 0.99），表明没有信号饱和。DPV计算的LOD和LOQ（0.19和0.64 μg mL^?1）低于EIS，表明性能增强。重复测量的RSD值证明可接受的重现性，DPV的RSD从基线的0.57改善到3.0 μg mL^?1时的0.33，与升高的分析物水平下增强的信噪比一致。尽管与EIS相比重现性稍差，但DPV更高的分析准确性使其成为在宽范围（0.0–3.0 μg mL^?1）内检测Cys-C的更合适选择。DPV校准曲线中更陡的斜率和更高的回归系数表明更大的分辨率和更精确的信号转换，特别是在低分析物浓度（0.0–0.5 μg mL^?1）下。该优势可能源于DPV的脉冲性质，它通过最小化电容背景电流和放大法拉第信号来提高信噪比。因此，DPV似乎更适用于e-MIP/SEs的蛋白质生物传感，其中需要高灵敏度和宽动态范围。

结论与未来工作

本研究展示了一种用于蛋白质检测的e-MIP传感平台的开发和系统评估，提供了在相同e-MIP/SE平台上对DPV和EIS信号转导策略的首次详细机械比较。选择Cys-C作为模型蛋白质，因其相对较小的尺寸（≈15 kDa）、有利的电荷特性（在生理缓冲液中带正电）、结构稳定性以及作为生物标志物（特别是在AKI诊断中）既定的临床相关性。这些特征使其成为在受控概念验证研究中探究印迹效率和信号转换的理想模型。在此基础上，进行了分子对接模拟以评估Cys-C与候选电活性单体之间的潜在相互作用，从而基于证据选择BTP-BCA作为有效蛋白质-单体相互作用的最佳单体。该选择告知了其兼容交联剂BTP的选择，确保了化学兼容的印迹条件。在优化恒电位条件下在SE表面电聚合聚联噻吩基识别层，产生了具有功能性印迹空腔和结构完整性的聚合物网络，通过全面的形态、形貌和光谱表征得到确认。

与非印迹e-NIP/SE对照不同，使用DPV和EIS的电化学表征证明了e-MIP/SEs对各种Cys-C浓度的目标特异性和浓度依赖性响应。通过浓度依赖趋势的机械分析揭示了潜在信号转导机制，其中e-MIP/SE表现出R_ct（EIS）的系统性减少和I_peak（DPV）的相应增加，随着蛋白质浓度增加，而e-NIP/SE在两种技术中显示极小变化。这些相反的信号方向代表了e-MIP/SE界面增强电子转移的互补表现，可能由三种主要机制驱动：通过带正电Cys-C与带负电氧化还原探针之间的有利相互作用进行静电促进；Cys-C结合时π-共轭聚联噻吩骨架内的半导体掺杂效应，增加电荷载流子密度；以及通过蛋白质诱导的聚合物基质内修饰增强离子传输，其中结合蛋白质可以创建亲水通道或改变局部离子强度。

虽然两种技术都证明了蛋白质特异性识别，但DPV表现出更优的分析性能，提供更低的LOD（0.19 μg mL^?1）和LOQ（0.64 μg mL^?1）、更宽的线性范围（0.1–3.0 μg mL^?1）和更高的灵敏度（0.38 μA μg^?1 mL）与EIS相比，EIS表现出双相线性响应，具有两个不同的区域，从0–0.5到0.5–3.0 μg mL^?1，灵敏度随着Cys-C浓度增加从-29 kΩ μg^?1 mL（R² = 0.73）下降到-1.9 kΩ μg^?1 mL（R² = 0.94）。相应的LOD和LOQ值对于较低浓度范围（0.0–0.5 μg mL^?1）分别计算为0.53和1.78 μg mL^?1，对于较高浓度范围（0.5–3.0 μg mL^?1）分别计算为0.99和3.31 μg mL^?1。DPV的优越性能归因于脉冲测量技术提供的电容电流抑制和增强的法拉第信号放大，使其成为与EIS相比更便捷的蛋白质传感策略。此外，初步再生研究表明e-MIP/SE平台可以重复使用。在第二次洗涤步骤和重新与Cys-C孵育后，DPV信号保留了其原始灵敏度的75%，表明印迹位点保持活性且可被分析物接近。

必须重申，我们的主要目标不是开发一个全面的生物传感器（这通常需要广泛评估各种其他分析性能参数，如印迹质量、特异性、选择性和重现性），而是建立一个系统方法，由对最常用电化学检测策略的机械理解支持，以指导未来用于蛋白质传感的e-MIP生物传感器设计。尽管如此，必须承认几个局限性以告知未来生物传感器设计。首先，有限的重复（