硒缺乏通过SELENOT/mtROS/NADPH轴诱导鸡骨骼肌肌动蛋白细胞骨架崩溃和双硫死亡（Disulfidptosis）的机制研究

本综述揭示了硒（Se）缺乏通过下调硒蛋白T（SELENOT）表达，诱导线粒体活性氧（mtROS）过度产生，进而导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）代谢紊乱和双硫死亡（Disulfidptosis），最终引起骨骼肌萎缩的全新机制。研究明确了SELENOT/mtROS/NADPH信号轴在肌肉萎缩中的核心作用，为治疗肌肉萎缩性疾病提供了潜在靶点。

硒缺乏与骨骼肌萎缩：从分子机制到治疗启示

引言

骨骼肌是成年动物体内最大的组织，占体重的40-50%，在维持姿势支持、力量产生和运动表现等基本生理功能中扮演着重要角色。骨骼肌萎缩是一种严重的健康问题，其特征是肌肉质量和力量的进行性丧失，常见于废用、肌营养不良和神经压迫性损伤等多种病理过程。氧化应激是导致肌肉萎缩的关键因素，参与激活骨骼肌中的代谢重编程和泛素相关蛋白酶体系统。

近年来，一种新型的程序性细胞死亡方式——双硫死亡（Disulfidptosis）引起了学界关注。这种细胞死亡形式以异常二硫键积累为标志，引发细胞骨架崩溃。与涉及铁依赖脂质过氧化的铁死亡不同，双硫死亡是由NADPH耗竭诱导的二硫键应力选择性破坏细胞骨架蛋白所致。

硒作为脊椎动物必需的微量元素，通过硒蛋白生物合成参与抗氧化、增强免疫和调节组织代谢等多种生物过程。肌肉中的硒浓度与肌肉质量和力量呈正相关，硒缺乏常与肌肉疼痛、近端无力和慢性疲劳等临床表现相关。硒蛋白T（SELENOT）作为一种重要的膜结合硒蛋白，具有硫氧还蛋白样结构，表现出强抗氧化活性，但在骨骼肌中的功能尚未完全阐明。

SELENOT表达水平的变化

本研究通过建立硒缺乏鸡模型，利用转录组和蛋白质组学分析研究了硒缺乏对骨骼肌中硒蛋白表达水平的影响。相关性分析结果显示，饲喂正常日粮和硒缺乏日粮的鸡之间硒蛋白表达谱存在显著差异。

主成分分析确定了受硒缺乏影响的关键硒蛋白，发现在三维空间中，10种硒蛋白转录本和9种硒蛋白呈现出明显的聚类模式。硒缺乏导致骨骼肌中11种硒蛋白转录本和8种硒蛋白水平下调，其中SELENOT的转录和蛋白水平下调最为显著。

通过免疫荧光、免疫组化和Western blot分析进一步证实了硒缺乏饮食降低了鸡骨骼肌中SELENOT表达水平。体外实验中，研究人员提取了鸡胚胎原代成肌细胞，诱导分化7天形成肌管。激光共聚焦显微镜发现SELENOT与线粒体外膜蛋白TOM20在肌肉细胞中共定位。使用si-T和pcDNA-T质粒分别敲低和过表达SELENOT蛋白表达，发现SELENOT敲低后线粒体中SELENOT荧光强度和蛋白表达显著降低，与饲喂硒缺乏饮食鸡的SELENOT水平变化一致；而SELENOT过表达则显著提高了线粒体中SELENOT荧光强度和蛋白表达。

SELENOT下调对肌动蛋白细胞骨架和代谢过程的影响

通过分析骨骼肌组织的RNA和蛋白质测序，研究了硒缺乏鸡骨骼肌对SELENOT下调的响应。研究检测到18933个基因，包括1743个差异表达基因（DEGs），其中928个上调和815个下调。同时鉴定出464个差异表达蛋白（DEPs），其中256个显著上调和208个显著下调。

在这些DEPs和DEGs中，290个在基因和蛋白水平上均受到显著调控。Venn分析显示232个DEPs（123个上调和109个下调）在基因和蛋白水平的表达趋势一致。九象限图说明了转录组和蛋白质组数据之间的相关性，发现123个mRNA及其对应蛋白一致上调，109个一致下调；11个mRNA上调而蛋白下调；47个mRNA下调而蛋白上调。

通过加权基因共表达网络分析构建了具有一致表达趋势的mRNA和蛋白质的共表达网络，突出了共表达基因和蛋白质与三羧酸循环（TCA循环）、磷酸戊糖途径（PPP）和细胞骨架蛋白途径的关联。基因本体（GO）功能分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，共上调的基因和蛋白主要富集在与肌动蛋白细胞骨架、肌肉萎缩和氧化应激相关的通路中，包括微管解聚、肌肉收缩、肌球蛋白复合物、F-肌动蛋白帽状蛋白复合物、支架蛋白结合、肌动蛋白结合和对过氧化氢的反应等功能术语。

共下调的DEGs和DEPs主要富集在含碳化合物的合成和代谢方面，主要涉及糖和NADPH代谢的改变，如磷酸戊糖支路的调节、NAD(P)H氧化酶活性的正调节、甘油-3-磷酸生物合成过程、对碳水化合物的反应、糖酵解过程和NADPH磷酸酶活性。还发现细胞对抗氧化应激的能力和合成含硒蛋白的能力在共下调的DEGs和DEPs中富集。

KEGG结果显示，共上调的DEGs和DEPs显著富集在与氧化应激反应、细胞骨架破坏和肌肉病理相关的通路中，包括调节肌动蛋白细胞骨架、FoxO信号通路、肌萎缩侧索硬化、谷胱甘肽代谢和MAPK信号通路。相比之下，共下调的DEGs和DEPs主要富集在产生能量和合成NADPH的关键代谢通路中，如磷酸戊糖途径、柠檬酸循环（TCA循环）、糖酵解/糖异生、碳代谢和硒化合物代谢。这些结果表明，硒缺乏期间SELENOT下调破坏了骨骼肌细胞中的肌动蛋白细胞骨架组织和代谢稳态。

SELENOT维持鸡骨骼肌线粒体氧化还原稳态

通过评估线粒体呼吸链复合物表达和活性的变化，确定了SELENOT在线粒体中的精确作用。Western blotting和酶活性测定结果显示，SELENOT缺陷鸡骨骼肌中线粒体呼吸链复合物的表达和功能受损。

二氢乙锭（DHE）染色出现红色信号表明ROS积累，与氧化应激水平增加相关。4-HNE是重要的脂质过氧化标志物。鸡骨骼肌的DHE和4-HNE染色显示，SELENOT缺陷肌肉中的ROS水平显著高于对照组。SELENOT缺陷鸡骨骼肌中的抗氧化酶（CAT、SOD1和SOD2）水平显著低于对照组，表明SELENOT缺陷鸡对抗氧化应激的能力较低。

通过体外研究SELENOT在调节肌肉细胞氧化应激中的作用，发现SELENOT敲低破坏了线粒体呼吸链复合物的表达并降低了其酶活性，模拟了硒缺乏的影响。这种破坏通过给予mtROS抑制剂TEMPO部分得到挽救。相反，SELENOT过表达减轻了硒缺乏诱导的线粒体呼吸链复合物表达抑制及其功能活性，而mtROS激活剂鱼藤酮消除了这种保护作用。

流式细胞术和MitoSOX染色结果显示，SELENOT敲低诱导了线粒体ROS积累，TEMPO处理减轻了这种积累。此外，SELENOT过表达减少了硒缺乏诱导的线粒体ROS水平增加，而鱼藤酮处理消除了这种保护作用。总细胞内ROS水平的变化与mtROS水平的变化一致。

通过检测肌肉细胞中细胞内抗氧化酶的影响，发现SELENOT敲低和硒缺乏肌肉细胞中的抗氧化酶水平低于对照细胞，添加TEMPO后部分恢复。SELENOT过表达提高了由硒缺乏引起的低水平抗氧化酶，而鱼藤酮逆转了这些水平。

总之，SELENOT与鸡骨骼肌中的线粒体氧化还原稳态密切相关。SELENOT缺陷加剧了线粒体呼吸链的破坏和mtROS水平的增加，而SELENOT过表达有助于维持正常的线粒体呼吸链复合物功能并抑制氧化应激。

SELENOT通过mtROS调节鸡骨骼肌NADPH代谢

葡萄糖是细胞能量代谢的重要底物。NADPH通过PPP、三羧酸和柠檬酸-丙酮酸途径持续产生。通过鸡骨骼肌的PAS和IDH1/G6PD染色，表征了SELENOT在NADPH代谢中对骨骼肌的作用。

研究发现，与对照组相比，SELENOT缺陷降低了鸡骨骼肌中葡萄糖和糖原的合成。IDH1和G6PD是三羧酸循环和磷酸戊糖途径的关键酶，它们的合成也受到SELENOT缺陷的抑制。参与PPP的酶包括己糖激酶II、LDHA、G6PD、PGLS和PGD，这些酶的水平在SELENOT缺陷鸡的骨骼肌中下调。参与TCA循环和柠檬酸-丙酮酸途径的酶，如IDH1、IDH2、MDH1、α-KG、ME2和CS，其水平同样因缺乏SELENOT而降低。SELENOT缺陷鸡骨骼肌中的NADPH水平低于对照组，这表明SELENOT缺陷抑制了鸡骨骼肌中NADPH的合成代谢。

检测鸡血清中的葡萄糖水平发现，硒缺乏条件下的血清葡萄糖水平低于对照组。通过深入研究SELENOT调节肌肉细胞中NADPH合成的内在机制，时间分析显示，SELENOT敲低后3小时内mtROS水平增加，而NADPH耗竭仅在12-24小时后明显。早期（3小时）使用TEMPO处理抑制了mtROS积累并防止了随后的NADPH耗竭，而晚期（12小时）NADPH补充未能减轻mtROS过量产生，确立了mtROS水平升高是起始事件。

研究发现，硒缺乏或SELENOT敲低降低了肌肉细胞中的葡萄糖含量和IDH1/G6PD表达，使用TEMPO抑制细胞内mtROS产生有效缓解了这些变化。此外，SELENOT过表达抑制了由硒缺乏引起的葡萄糖含量和IDH1/G6PD表达的降低；这些变化通过添加mtROS激活剂鱼藤酮而逆转。

通过评估氧消耗率（OCR，反映氧化磷酸化/OXPHOS）和细胞外酸化率（ECAR，指示糖酵解通量），研究了SELENOT对鸡骨骼肌细胞葡萄糖代谢的影响。数据显示，硒缺乏或SELENOT敲低损害了线粒体OXPHOS能力，同时抑制了糖酵解活性，这通过基础糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备的减少得到证明。这些代谢扰动通过TEMPO处理显著逆转。SELENOT过表达有效改善了硒缺乏诱导的OXPHOS和糖酵解损伤。与mtROS激活剂鱼藤酮共同处理加剧了这些代谢功能障碍。

参与NADPH生成的关键酶表达水平和细胞内NADPH含量在硒缺乏或SELENOT敲低细胞中也受到抑制。PPP、己糖激酶II、LDHA、G6PD、PGLS、PGD、TCA循环和柠檬酸-丙酮酸途径中的IDH1、IDH2、MDH1、α-KG、ME2和CS也受到抑制。这些变化通过添加TEMPO而逆转。SELENOT过表达有效缓解了硒缺乏细胞中PPP、TCA循环和柠檬酸-丙酮酸途径关键酶的抑制，并恢复了细胞内NADPH水平。添加鱼藤酮产生了与SELENOT过表达相反的结果。

总体而言，SELENOT缺陷通过mtROS抑制了鸡骨骼肌中的NADPH合成代谢，有效降低骨骼肌中的mtROS水平有利于NADPH合成。

SELENOT缓解NADPH缺乏引起的SLC7A11^high和双硫死亡

SLC7A11参与细胞外胱氨酸的摄取和谷氨酸的释放。SLC7A11通过消耗NADPH促进谷胱甘肽合成，维持细胞氧化还原平衡。研究发现，与对照组相比，SELENOT缺陷增加了鸡骨骼肌中的SLC7A11蛋白水平。

氨基酸分析显示，SELENOT缺陷鸡肌肉组织中积累的胱氨酸显著更多，谷氨酸显著少于对照鸡。骨骼肌合成GSH的能力受到SELENOT缺陷的影响：GSH和GSH/GSSG水平下调，GSSG水平较高。

胱氨酸是一种高度不溶性的氨基酸，大量积累时会引发双硫死亡。通过检测与双硫死亡相关的RAC/WAVE复合物的蛋白水平，发现SELENOT缺陷鸡骨骼肌中形成了RAC/WAVE复合物，这通过RAC、WAVE、NCKAP1、CYFIP1和ABI2表达水平的上调得到证实。

通过非还原Western blotting验证了SELENOT缺陷诱导的肌动蛋白细胞骨架蛋白中二硫键的形成。二硫键的形成影响非还原条件下蛋白质的电泳迁移率。SELENOT缺陷导致各种肌动蛋白细胞骨架蛋白在非还原条件下以扩散条带形式迁移较慢。SELENOT缺陷在还原条件下未诱导这些蛋白质的相同迁移模式，表明这些肌动蛋白细胞骨架蛋白在SELENOT缺陷条件下形成了多个分子间二硫键。

通过深入研究确定mtROS/NADPH是否是SELENOT介导骨骼肌细胞双硫死亡的直接因素，发现与对照组相比，SELENOT敲低诱导了鸡骨骼肌中高水平的SLC7A11，细胞摄取了大量胱氨酸。SELENOT敲低还诱导了谷氨酸缺乏，抑制了肌肉细胞中GSH的合成，这与硒缺乏状态下肌肉细胞的状态一致。添加TEMPO抑制mtROS、补充NADPH或SLC7A11敲低有助于逆转肌肉细胞中的上述影响，缓解胱氨酸积累和GSH/GSSG减少。

此外，SELENOT过表达有效缓解了由硒缺乏引起的高SLC7A11水平以及胱氨酸积累，并降低了GSH/GSSG表达水平。SELENOT过表达的缓解作用通过添加mtROS激活剂鱼藤酮或NADPH抑制剂BAY-876而丧失。

研究发现，硒缺乏或SELENOT敲低促进了肌肉细胞中RAC/WAVE复合物与其介导的肌动蛋白细胞骨架之间二硫键的形成，与体内结果相似。抑制mtROS、补充NADPH或SLC7A11敲低有效防止了这些变化，抑制了二硫键形成。SELENOT过表达缓解了LSe组中RAC/WAVE复合物与其介导的肌动蛋白细胞骨架之间二硫键的形成。添加鱼藤酮或BAY-876逆转了这种效应。

还研究了二硫键形成后骨骼蛋白的状态，以检测肌肉细胞是否发生了双硫死亡。F-肌动蛋白与膜染料phalloidin的共染色显示，硒缺乏或SELENOT敲低诱导了F-肌动蛋白从肌肉细胞质膜上脱离。通过添加TEMPO或NADPH，或SLC7A11敲低，恢复了正常细胞状态。SELENOT过表达缓解了降低的F-肌动蛋白水平，而鱼藤酮或BAY-876处理阻止了这种缓解。

总体而言，数据表明SELENOT缺陷导致由mtROS水平增加引起的NADPH缺乏。这一过程创造了SLC7A11^high状态，导致肌动蛋白细胞骨架蛋白中异常二硫键形成，随后F-肌动蛋白水平降低和F-肌动蛋白从细胞质膜上脱离。SELENOT过表达维持细胞内NADPH产生和氧化还原平衡，防止双硫死亡。

为了进一步验证SELENOT缺陷诱导肌动蛋白与其他细胞骨架蛋白之间二硫键形成的假设，对SELENOT敲低细胞中的内源性肌动蛋白进行了免疫沉淀。考马斯蓝染色结果显示，SELENOT敲低在非还原条件下诱导了肌动蛋白与堆积胶附近高分子量蛋白质的共免疫沉淀（红色框）。这些蛋白质的共免疫沉淀在还原条件下发生偏移。随后对免疫沉淀蛋白质进行了质谱分析，鉴定出五对二硫键，包括MYH9 Cys172–Cys511、Cys118–Cys172、Cys739–Cys1379、FLNB Cys51–Cys197和FLNA Cys428–Cys462键。

SELENOT缓解双硫死亡介导的骨骼肌萎缩

由于异常肌动蛋白细胞骨架稳定性在骨骼肌萎缩中的潜在作用，评估了在42天喂养周期中SELENOT缺陷对鸡体重的影响。在前14天，各组鸡的初始体重相当（对照组：0.32 ± 0.03 kg vs LSe：0.31 ± 0.02 kg）。然而，此后硒缺乏鸡的生长受到抑制，在30天和42天时分别比对照鸡轻26.8%和24.6%。

使用苏木精和伊红（H&E）染色的组织病理学检查证明了硒缺乏鸡骨骼肌的特征性形态和结构改变，包括肌纤维萎缩和结构紊乱。层粘连蛋白免疫荧光染色用于精确量化这些改变的纤维横截面积，硒缺乏鸡的纤维横截面积（2446.4 ± 315.7 μm2）比对照组（3402.6 ± 334.2 μm2）小28.1%。形态学改变的效应量大（Cohen's d = 2.94），统计功效>0.99（每组n=45），证实了研究结果的稳健性。

免疫荧光和Western blotting结果表明，硒缺乏通过协调分解代谢通路的激活和抑制再生能力促进了骨骼肌萎缩。观察到硒缺乏肌肉中萎缩标志物MuRF1和Atrogin-1表达水平显著上调，同时伴随成肌调节因子肌母细胞决定蛋白（MyoD）、肌细胞生成素（MyoG）和生肌因子5（Myf5）以及结构蛋白肌球蛋白重链（MyHC）水平的下调。

通过检查硒缺乏或SELENOT敲低是否影响体外肌肉萎缩，发现硒缺乏组和SELENOT敲低组的肌纤维直径显著小于对照组。然而，添加TEMPO或NADPH有效，或SLC7A11敲低有效挽救了体外肌肉萎缩。SELENOT过表达缓解了由硒缺乏引起的肌肉细胞萎缩，而添加鱼藤酮或BAY-876消除了这种效应。

肌肉萎缩标志物（MuRF1和Atrogin-1）的表达水平在硒缺乏或SELENOT敲低后显著升高，而成肌调节因子（MyoD、MyoG、Myf5和MyHC）的蛋白表达水平显著降低。这些变化通过添加TEMPO或NADPH或SLC7A11敲低而逆转。此外，SELENOT过表达抑制了MuRF1和Atrogin-1的表达水平，增加了成肌调节因子（MyoD、MyoG、Myf5和MyHC）的蛋白水平，逆转了由硒缺乏引起的肌管萎缩。然而，这一过程通过添加鱼藤酮或BAY-876而阻断。

这些发现表明，硒缺乏通过协调蛋白质降解通路的激活和损害分化状态维持诱导骨骼肌萎缩，这些过程由SELENOT缺陷通过mtROS/NADPH轴触发的双硫死亡介导。SELENOT过表达通过防止双硫死亡和维持细胞骨架蛋白稳定性发挥保护作用。

讨论与展望

硒缺乏引起各种临床和病理症状，是诱导骨骼肌疾病的关键因素。硒缺乏通过促进ROS产生诱导骨骼肌萎缩，导致患者肌肉疼痛和疲劳。硒的生物学功能主要由硒蛋白介导。本研究揭示了在各种硒蛋白表达中，SELENOT表达在硒缺乏鸡骨骼肌中受到最强调控。获得了组织学和分子证据，表明SELENOT缺陷通过过量产生mtROS诱导鸡骨骼肌中二硫键积累，导致细胞骨架蛋白异常和加速肌肉质量损失。此外，SELENOT过表达维持氧化还原稳态，支持NADPH合成和代谢，并有效防止硒缺乏诱导的肌肉萎缩。这些发现为了解SELENOT与骨骼肌疾病之间的机制联系提供了见解。

所有硒蛋白的表达水平都依赖于硒，但不同硒蛋白对硒水平的敏感性似乎存在等级关系。SELENOT对硒缺乏的反应比该家族中的其他蛋白质更强烈。研究结果支持这一假设。与许多其他硒蛋白相比，SELENOT转录和蛋白表达水平最强调控硒含量的变化。SELENOT转录和蛋白表达水平与日粮中的硒水平呈正相关。这表明日粮硒缺乏加剧了鸡骨骼肌中SELENOT的丢失。SELENOT是一种重要的膜结合硒蛋白，主要位于线粒体和内质网。SELENOT具有硫氧还蛋白的中心结构特征，导致强抗氧化活性。通过共聚焦激光显微镜确认SELENOT主要定位于鸡骨骼肌细胞的线粒体外膜。体内和体外实验结果表明，硒缺乏诱导的SELENOT下调损害了线粒体呼吸链复合物表达，导致mtROS过量产生。评估了由此产生的抗氧化酶水平，发现SELENOT缺陷导致CAT、SOD1和SOD2的过度消耗，加剧了细胞氧化应激。SELENOT过表达通过增强线粒体呼吸链复合物表达恢复了氧化还原平衡。使用TEMPO和鱼藤酮进行药理学调节证实mtROS直接破坏线粒体呼吸链复合物表达。这些发现表明，硒缺乏诱导的线粒体功能障碍启动了一个自我放大的循环，其中mtROS过量产生进一步破坏氧化还原稳态。这一发现支持了先前的研究，即这种氧化还原失衡加剧线粒体损伤，完成了一个致病性反馈循环。时间分析结果揭示了一个明确的机制级联，其中线粒体中的ROS生成作为代谢失调的主要启动因子。观察到的mtROS升高先于NADPH耗竭的顺序模式强烈支持氧化应激是启动这一病理过程的因素，而不是次要后果。这种因果关系在干预研究结果的不同中得到进一步强化：早期抗氧化治疗有效防止了NADPH耗竭；晚期NADPH补充未能逆转已建立的氧化应激。

葡萄糖是细胞NADPH代谢的主要底物，通过多种代谢途径支持NADPH生成。G6PD通过细胞质中的PPP催化NADP+还原为NADPH，贡献约40%的细胞还原当量。线粒体TCA循环不直接合成NADPH；然而，代谢中间体通过柠檬酸-丙酮酸穿梭为生成NADPH提供了必需的前体。体内和体外实验揭示，硒缺乏破坏了鸡骨骼肌中的NADPH合成和代谢，其特征是与对照相比，PPP和柠檬酸-丙酮酸穿梭途径关键酶表达水平较低，NADP+/NADPH比率升高。这些效应通过SELENOT过表达而改善。GO和KEGG分析表明硒缺乏诱导葡萄糖代谢通路下调，包括PPP、TCA循环和碳水化合物反应通路，因为ROS作为信号分子调节代谢重编程。体外实验结果证实，SELENOT敲低后葡萄糖摄取减少，表明骨骼肌细胞发生了代谢重编程。

提出mtROS是SELENOT缺陷期间代谢重编程的关键介质。使用mtROS抑制剂和激活剂进行药理学调节的结果证实，SELENOT缺陷诱导的mtROS过量产生介导代谢重编程，抑制PPP、TCA循环和柠檬酸-丙酮酸穿梭，最终损害NADPH合成。硒缺乏和低血糖在健康成人中相关。与这一发现一致，发现硒缺乏鸡的血清葡萄糖水平显著降低，表明硒缺乏下骨骼肌中观察到的代谢和氧化应激效应导致了葡萄糖稳态的系统性变化。这些发现突出了在硒缺乏条件下使用血清生物标志物监测肌肉相关效应的潜力。

SLC7A11^high细胞在低葡萄糖条件下通过细胞骨架崩溃经历细胞死亡，这主要是由细胞质胱氨酸积累和NADPH耗竭后过度的肌动蛋白二硫键形成驱动。双硫死亡由氧化还原失衡驱动，与铁死亡相似；然而，这些通路在代谢需求上不同，并依赖于铁和脂质过氧化。双硫死亡源于葡萄糖剥夺诱导的NADPH耗竭，损害蛋白质二硫键的还原，特别是在具有高SLC7A11表达的细胞中。研究结果建立在