基于抗体-抗原响应型酶开关（Switchbody）的创新生物传感器开发及其“捕获-释放”机制解析

本文推荐一种新型抗原响应型酶开关技术“Switchbody”，通过将抗体与分裂酶片段（HiBiT/LgBiT）融合，实现抗原依赖性生物发光调控。研究结合X射线晶体学、NMR及分子动力学模拟，揭示其“捕获-释放”（Trap and Release）机制，并成功将商品化IgG抗体转化为免标记生物传感器。该平台为高时空分辨率生物检测、细胞功能调控及靶向药物递送提供了新策略。

　　

1 引言

蛋白质通过动态结构变化响应配体结合、膜电位变化、pH/温度波动等外部刺激，从而调控代谢、信号转导等细胞生理功能。人工调控蛋白质“开关”状态可实现对细胞功能的高时空分辨率控制或可视化。现有蛋白开关技术（如光敏感LOV2结构域、DREADD受体、Tet系统等）虽广泛应用，但其刺激响应类型受限于蛋白质固有特性。

抗体因其高亲和力和特异性成为理想开关组件。已有研究将抗体与分裂酶（如RNA聚合酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等）融合，通过抗原诱导的分裂酶重构实现转录调控或抗原定量。然而，这些方法通常需双抗体或V_H/V_L域结合，对蛋白浓度、空间取向和距离要求严苛。本研究基于单抗体策略，开发了抗原触发的荧光素酶开关“Switchbody”。

2 结果与讨论

2.1 Switchbody的构建与表征

以抗人骨钙蛋白（BGP）抗体KTM219的单链抗体（scFv）为模型，在其N端通过柔性连接子（G₃S或(G₃S)₂）融合11肽HiBiT（NanoLuc荧光素酶小片段）。SDS-PAGE证实成功表达并纯化scFv、Switchbody (L1)和(L2)。BLI显示Switchbody亲和力略低于scFv，表明HiBiT位于抗原结合位点附近并产生空间位阻。

2.2 抗原依赖性发光增强

添加互补片段LgBiT及底物furimazine后，Switchbody在抗原BGP-C7存在下发光强度增强>3倍，而阴性对照BGP-C10dV无响应。剂量反应曲线显示Switchbody (L1)和(L2)的EC₅₀分别为3.3 nM和10 nM，发光增强可通过数码相机甚至肉眼观察。在含人血清/血浆的PBST中同样观察到剂量依赖性响应，但EC₅₀升高，可能与体液成分干扰有关。ELISA证实抗原结合促进HiBiT与固定化LgBiT的结合，支持“释放”机制。

2.3 X射线结构解析HiBiT捕获状态

Switchbody晶体结构（分辨率1.95 ?，PDB: 9LUK）显示HiBiT区域电子密度缺失，表明其处于异质态。与KTM219 Fab（PDB: 5X5X）相比，Switchbody的重链CDR区B因子更高且构象变化显著，提示HiBiT主要位于重链CDR附近，以非特异性方式被“捕获”，类似于Q-body中荧光染料TAMRA的行为。

2.4 NMR揭示HiBiT动态变化

通过¹H-¹⁵N HSQC谱分析色氨酸（Trp）信号（HiBiT含1个Trp，scFv含5个Trp），发现抗原添加后出现新增信号x和y。弛豫时间测量显示信号x的R₂值显著低于其他信号，表明其对应HiBiT中的Trp，抗原结合后运动性增加。

2.5 MD模拟预测“捕获-释放”机制

基于scFv晶体结构（有/无抗原）进行3.0 μs MD模拟。结果显示：无抗原时，HiBiT与重链CDR-H1/H2、FR-H3及轻链CDR-L3频繁接触；有抗原时，相互作用位点转移至CDR-H3、CDR-L1/L2。接触频率差异图提示抗原结合显著改变HiBiT-抗体相互作用模式。关键残基突变验证（如D52_HA、D54_HA）证实盐桥（如D52_H/D54_H与HiBiT K9）破坏可减弱捕获作用，提高本底发光。

2.6 蛋白M介导的免标记IgG转化

利用源自生殖支原体的抗体结合蛋白M（PM）构建PM-HiBiT探针（含不同长度连接子），可与多种商品化IgG（如抗BGP、抗甲状腺素、抗TARGET-tag抗体）结合形成复合物。优化连接子长度后，复合物在对应抗原存在下显示剂量依赖性发光增强（抗甲状腺素IgG最佳响应为PM-HiBiT (L2)）。大分子抗原（如乳铁蛋白、C反应蛋白）响应方向不一，可能与空间位阻或表面相互作用有关。该策略无需基因操作即可筛选潜在Switchbody抗体。

3 结论

本研究提出并验证了基于“捕获-释放”原理的荧光素酶开关Switchbody。通过多技术手段（结构生物学、波谱学、计算模拟）阐明其工作机制，并拓展至蛋白M介导的通用型抗体传感器平台。该技术有望推动免疫检测、细胞功能调控及靶向药物（如可裂解连接子偶联药物）的发展。未来需优化对大分子抗原的响应并精确调控开关亲和力以扩大应用范围。