双功能化细胞外囊泡靶向递送VEGF促进小鼠缺血性脑卒中后的脑修复与重塑

本研究开发了一种RGD肽表面修饰并负载VEGF的双功能化神经干细胞源细胞外囊泡(EV)平台，通过协同靶向整合素αVβ3和增强血管生成/神经生成双重作用，显著改善缺血性脑卒中小鼠的脑修复与神经功能恢复，为脑卒中再生治疗提供了新策略。

　　

引言

缺血性脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因之一，治疗选择有限。当前FDA批准的唯一下游治疗药物重组组织纤溶酶原激活剂(rtPA)因治疗时间窗窄、出血风险高和严格 eligibility 标准，仅约5%卒中患者符合治疗条件。细胞外囊泡(EV)作为纳米级脂质双层囊泡(30-200nm)，在细胞间通讯中扮演重要角色，具有低免疫原性、低毒性和穿越血脑屏障(BBB)的能力，成为缺血性脑卒中治疗的有前景候选者。神经干细胞源EV(NSC-EV)可增强神经元存活、减少炎症、调节免疫微环境、促进血管生成并抑制脑细胞凋亡。然而，天然EV在缺血脑区特异性积累能力差，限制了其治疗效果。

为克服此限制，研究者采用表面修饰技术提高EV靶向能力。铜游离生物点击化学(bio-click chemistry)可通过三唑形成实现位点特异性靶向肽共价连接，而不影响EV完整性或生物活性。其中，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽因对整合素αVβ₃的高亲和力而备受关注，该受体在缺血组织活化内皮细胞上选择性上调，在血管生成中起核心作用。除改善EV靶向外，增强EV治疗载荷也至关重要。血管内皮生长因子(VEGF)是经过充分研究的促血管生成和神经保护细胞因子，不仅促进血管重塑和神经发生，还上调整合素αVβ₃表达，可能通过正反馈机制增强RGD介导的靶向。

传统加载技术如超声处理或孵育显示加载效率低于30%。为应对此问题，研究者转向链球菌溶血素-O(SLO)，这是一种与富含胆固醇膜结合的溶细胞素，可寡聚化形成小于30nm直径的瞬时孔道，为药物创建可逆渗透化，显著提高封装效率 compared to 被动方法。

材料与方法

原代NSC分离与培养

从胚胎第15天(E15)C57/Bl6J小鼠皮层分离NSC，用含1%B-27、20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/mL表皮生长因子(EGF)和1%青霉素G(100units/mL)及链霉素(100μg/mL)的无血清DMEM/F12(1:1)培养基培养。

EV分离、表征与标记

通过超速离心从P0至P5代NSC条件培养基中分离EV：300×g离心10分钟，2000×g离心10分钟，10000×g离心35分钟，最后100,000×g超速离心70分钟。通过Western blot检测EV特异性蛋白TSG101和CD9，以GM130作为阴性对照。透射电子显微镜(TEM)显示EV形态，纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测EV尺寸。用PKH26或DIR染料标记EV。

EV工程化与表征

通过铜游离生物点击化学将RGD肽连接到EV表面：首先将反应性二苄基环辛炔(DBCO)与NSC-EV表面蛋白共价连接，然后引入RGD-N₃肽，与EV表面DBCO形成稳定三唑连接。使用SLO加载VEGF：先使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)激活SLO，然后将EV与激活SLO和VEGF孵育。通过免疫荧光染色(IF)、zeta电位测量和Western blot验证成功生物工程化。通过BCA测定加载效率，ELISA测定药物释放曲线。

体外细胞毒性、摄取与迁移效应

使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)测定人脐静脉内皮细胞(HUVEC)活力。用PKH26标记EV分析HUVEC摄取，使用ImageJ分析荧光强度。通过划痕实验和Transwell迁移实验评估HUVEC迁移能力。

短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)模型

按照ARRIVE指南和上海交通大学机构动物护理与使用委员会(IACUC)指南进行动物实验。通过激光多普勒血流仪(LDF)监测脑血流量(CBF)，成功闭塞标准为CBF降至基线10%-20%，成功再灌注标准为CBF恢复至基线70%。

动物实验设计与行为测试

87只8周龄雄性C57/Bl6小鼠随机分为6组：假手术组、PBS组、天然EV组、RGD-EV组、VEGF-EV组、RGD-VEGF-EV组。卒中后第7至14天每隔一天通过尾静脉注射100μg EV。通过改良神经严重程度评分(mNSS)、旋转棒实验、平衡木实验和悬挂实验评估神经行为功能。

梗死体积评估与生物分布

通过尼氏染色计算萎缩体积。使用活体成像系统(IVIS)检测DIR标记EV的生物分布。通过免疫荧光染色分析EV的细胞摄取。

结果

生物工程化EV的制备与表征

成功通过生物点击化学将RGD缀合到EV表面，并通过SLO加载VEGF。荧光标记、zeta电位测量和Western blot证实成功生物工程化。RGD-VEGF-EV的VEGF加载效率超过70%。天然和生物工程化EV均对EV特征蛋白TSG101和CD9呈阳性，对高尔基体蛋白GM130呈阴性。生物工程化EV的形状和大小在各组间相似，TEM分析证实所有生物工程化EV均保持典型的杯状形态。有趣的是，VEGF-EV在48小时后释放超过85%的初始加载VEGF，而RGD-VEGF-EV释放不到50%。在4°C PBS中储存的RGD-VEGF-EV在工程化后6天内尺寸稳定。

体外细胞相容性、摄取与迁移效应

用RGD-VEGF-EV处理24小时后，HUVEC活力未改变。3D共聚焦成像证实EV在体外被内化。确定20μg/mL EV剂量用于后续体外实验，因此剂量在9小时后增加HUVEC迁移。分析PKH26染色生物工程化EV在HUVEC中3小时后的摄取。为确认RGD-αVβ₃靶向导致EV摄取增加，添加了两个对照组：DBCO和RGD阻断组。在DBCO组中，仅将DBCO连接到EV表面，没有RGD肽。在RGD阻断条件下，HUVEC先用RGD孵育以阻断αVβ₃结合位点，然后再用RGD-EV孵育。DBCO-EV和RGD阻断条件下EV的摄取未增加。RGD-EV摄取增加3倍，RGD-VEGF-EV摄取增加5.2倍。

在划痕迁移实验中，用生物工程化EV刺激9小时后分析迁移距离。与天然或单功能化EV刺激相比，RGD-VEGF-EV增加细胞迁移。在Transwell迁移实验中，用生物工程化EV刺激16小时后分析迁移的HUVEC。与无EV刺激相比，HUVEC迁移增加2.1倍。与划痕试验结果相似，与天然或单功能化EV刺激相比，RGD-VEGF-EV显著增加细胞迁移。

体内生物分布

通过IVIS确定Cy5.5标记EV的生物分布和靶向能力。与VEGF-EV相比，RGD-VEGF-EV在大脑中的辐射效率高5倍。大部分RGD-VEGF-EV积聚在肝脏和肠道中。scr-VEGF-EV和VEGF-EV以 comparable 速率被摄取。

体内细胞摄取

通过免疫荧光染色检测生物工程化EV的体内细胞摄取。所有四种细胞类型(内皮细胞、星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞)均内化EV。与天然EV摄取相比，内皮细胞对RGD-VEGF-EV摄取增加1.5倍。神经元对RGD-VEGF-EV摄取比天然EV增加1.1倍。3D共聚焦成像验证了EV的体内细胞内存作用。

对萎缩体积和功能恢复的影响

天然和单功能化NSC-EV减少缺血性卒中后萎缩体积。此外，与无EV治疗相比，RGD-VEGF-EV治疗使萎缩体积减少71.8%，与天然EV或单功能化EV治疗相比减少50%以上。

在卒中后第14天，天然和生物工程化NSC-EV均降低mNSS评分和平衡木实验中穿越横梁所需平均时间。在悬挂实验中，VEGF-EV或RGD-VEGF-EV治疗增加平均悬挂时间。与天然或单功能化EV相比，RGD-VEGF-EV改善旋转棒实验中在棒上停留时间，达到与健康小鼠相当的水平。

促进血管生成与神经发生

为确定生物工程化EV治疗后神经行为改善和萎缩体积减少背后的机制，研究了它们对血管生成的影响。与天然EV治疗相比，用RGD-VEGF-EV治疗的小鼠显示血管密度增加1.6倍。此外，与天然EV治疗相比，用RGD-VEGF-EV治疗的小鼠中增殖内皮细胞数量增加。进一步观察发现，用RGD-VEGF-EV治疗的小鼠中增殖神经干细胞和祖细胞增加。

讨论

双功能化EV的表征

通过结合生物点击化学和EV加载成功生物工程化双功能化EV。常用主动加载方法显示加载效率低于30%。本研究使用SLO作为主动加载剂实现超过70%的高加载效率。首次证明生物点击化学不影响SLO的EV加载，反之亦然。两个生物工程化步骤均不影响EV的大小或形态。还观察到RGD-VEGF-EV的药物释放减少，这可能归因于EV表面RGD缀合。与现有文献比较仍具挑战性，因有限研究使用生物点击化学进行EV表面修饰。其中，仅Khan等报道了与RVG29缀合后的药物释放曲线，修饰与未修饰EV间无显著差异。值得注意的是，RVG29是相对较大的肽，由29个氨基酸组成，分子量约3300Da，而RGD是更小的三肽(~1.0nm)。由于其大小和结构简单性，更多RGD肽可能结合到EV表面DBCO上，潜在形成富含肽层，改变膜特性如刚性，从而影响药物释放动力学。药物释放延迟可能减少循环期间过早药物损失，增强向缺血大脑的递送效率，使双功能化EV对治疗应用更有效。

通过RGD功能化增强靶向

RGD肽对αVβ₃表现出高结合亲和力，该受体在缺血条件下在内皮细胞上选择性上调。体外和体内实验证实，用RGD对NSC-EV进行表面功能化通过与αVβ₃相互作用显著增强其与内皮细胞的结合和摄取。此外，发现将VEGF作为治疗载荷纳入EV有助于增强靶向效率。

这种双功能化创建了一个自我强化的正反馈循环，其中VEGF不仅促进血管生成，还放大其自身停靠受体αVβ₃的表达，从而增强后续EV摄取以及治疗递送。此种机制在基于EV的治疗中尚未被描述，代表了靶向药物递送的概念进展。与早期依赖非靶向EV或递送游离VEGF蛋白或基因治疗的策略相比，本研究方法独特地结合了空间精度与载荷效力，导致EV在缺血部位改善积累和更大治疗影响。通过整合靶向与治疗到一个反馈增强系统，此双功能化策略在卒中治疗中具有 superior 疗效和减少脱靶效应的潜力。

此外，观察到RGD介导的靶向不仅对内皮细胞，还对神经元，暗示此靶向策略对神经血管修复的更广泛适用性。这些联合效应显著改善NSC-EV在缺血脑区的定位和治疗效果。

VEGF加载增强治疗效力

体外实验证实VEGF加载EV显著增强内皮细胞迁移，表明(a)VEGF成功递送以及(b)其生物活性保存。体内，用RGD-VEGF-EV治疗导致血管生成促进，证据为梗死周围区血管密度和内皮增殖增加。这证实双功能化EV可选择性靶向缺血内皮细胞并触发修复性血管反应。除血管再生外，组织学分析显示，与用天然或单功能化EV治疗的动物相比，用RGD-VEGF-EV治疗显著减少缺血后15天小鼠的萎缩体积。重要的是，这些解剖学改善与增强功能恢复相关，特别是在感觉运动性能中，强调了靶向EV递送的治疗相关性。引人注目的是，仅RGD-VEGF-EV治疗导致神经源性生态位内神经干细胞和祖细胞增殖增加，提示与双功能化EV特异性相关的神经源性反应。此发现暗示，当VEGF以靶向方式高效递送到缺血大脑时，其全部神经再生潜力被最大化。

总之，这些发现强调了靶向递送与治疗载荷间的协同关系：虽然VEGF单独可促进血管再生，但其全部神经再生潜力似乎仅当通过RGD介导靶向高效递送到损伤部位时才被解锁。因此，EV双功能化代表了增强血管和神经再生的关键策略，最终导致缺血性卒中后改善结构和功能结果。

递送时间与生物学原理

在tMCAO后7天启动EV治疗，这个时间点选择基于强大生物学原理：(1)NSC增殖在卒中后7至14天达到峰值；(2)血管生成在卒中发作后数小时内开始，也在卒中后7至14天达到峰值；(3)VEGF应在卒中后至少48小时应用以避免不良影响如BBB渗漏。因此，卒中后7天是开始用负载VEGF的生物工程化EV治疗的理想时间点，以利用整合素αVβ₃表达峰值和内源性神经发生时期而不影响安全性。

局限性与未来方向

尽管有 promising 发现，必须承认一些局限性。首先，未量化工程化过程中的EV产量和潜在损失。Ruan等先前工作报道生物点击修饰后EV损失高达60%。两步过程可能招致类似损失。未来工作需旨在优化工作流程以增强EV回收，这对临床可扩展性和成本效益至关重要。

其次，评估聚焦于卒中后14天的短期治疗效果。为全面评估RGD-VEGF-EV的转化潜力，需要更长期研究。这些可能包括慢性结果评估、长期安全性分析，特别是关于免疫原性和脱靶效应。长期研究还可能更详细研究RGD-VEGF-EV对神经发生的影响，包括研究新神经元的整合和成熟。预期在长期研究中，RGD-VEGF-EV将显示比tMCAO后14天评估结果更 distinct 功能恢复，因为血管生成和神经生成效应将导致更多脑修复和重塑。

本研究中，VEGF被选为概念验证治疗载荷。然而，EV平台的模块化 enables 加载其他药剂如神经营养因子或小干扰RNA。未来研究可探索加载载荷组合或顺序释放策略以进一步增强基于EV治疗的疗效。

总之，生物工程化双功能化EV以增强靶向和治疗效力 of NSC源细胞外囊泡 for 缺血性卒中治疗。以RGD作为活化内皮细胞上整合素αVβ₃的靶向肽，VEGF作为治疗药物和αVβ₃表达增强剂，创建了一个用于RGD-VEGF-EV摄取和治疗效率的正反馈循环。结果强调了在EV设计中协同整合靶向配体和生物活性载荷的重要性。此双修饰平台不仅改善临床前卒中模型结果，还为神经血管疾病中基于EV治疗的未来转化发展奠定基础。