癌症相关成纤维细胞塑造结直肠癌侵袭前沿出芽癌细胞的形成：空间转录组学揭示CAF诱导EMT与转移新机制

本刊推荐：为解决结直肠癌转移初期侵袭前沿出芽癌细胞的形成机制问题，研究人员通过空间分子成像技术开展肿瘤微环境（TME）互作研究，发现癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过诱导上皮-间质转化（EMT）、细胞外基质（ECM）重构和迁移相关基因表达，驱动癌细胞播散，并鉴定出11基因转移特征谱（含TYK2、ITGB1等），为预后评估和靶向治疗提供新方向。

　　

在结直肠癌的治疗中，远处转移是导致患者死亡的主要原因。尽管手术可以切除原发性肿瘤，但一旦癌细胞脱离原发灶并形成转移灶，治疗将变得异常困难。在肿瘤进展的早期阶段，一种称为"肿瘤出芽"的现象引起了科学家们的注意——在肿瘤侵袭前沿，单个或成小簇的癌细胞从主体肿瘤中分离出来，这些细胞被认为是发生转移的"先锋部队"。然而，这些出芽癌细胞如何获得迁移能力？肿瘤微环境中的其他细胞如何参与这一过程？这些问题至今尚未完全阐明。

近日发表在《Communications Biology》的一项研究为这一领域带来了突破性进展。由Juan L. García-Rodríguez、Ulrik Korsgaard等研究人员组成的国际团队利用前沿的空间分子成像技术，深入解析了结直肠癌侵袭前沿癌细胞与肿瘤微环境之间的复杂相互作用，揭示了癌症相关成纤维细胞在促进癌细胞转移过程中的关键作用。

研究团队主要运用了四种空间技术：Spatial Molecular Imaging（SMI）技术（使用1000-plex基因panel分析4例患者样本）、10X Visium平台（5例患者）、nanostring GeoMx（3例患者）和RNAscope duplex分析（6例腺癌和3例腺瘤患者）。这些技术能够同时保留基因表达信息和空间位置信息，为了解细胞间的相互作用提供了独特视角。

准确的空间基因表达分析揭示正常结肠组织的细胞组成

研究人员首先在结构有序的相邻正常结肠组织上验证了SMI技术的性能。通过免疫荧光染色显示上皮细胞（pan-cytokeratin阳性）和T细胞（CD3阳性），并结合SMI技术成功识别了3108个细胞。UMAP分析和Leiden算法聚类揭示了9个不同的主要细胞簇，包括免疫细胞、成纤维细胞以及上皮来源的细胞（肠上皮细胞、杯状细胞、隐窝细胞和簇细胞）。这些上皮细胞严格位于隐窝内，与pan-cytokeratin染色完全一致，而其他细胞类型则位于隐窝间的基质中。差异表达基因分析显示了许多经典标志物，如上皮细胞的EPCAM、OLFM4和KRT19，成纤维细胞的COL1A2和ACTA2，B细胞和浆细胞的JCHAIN、MZB1和CD27，以及T细胞的CD3E。

结直肠肿瘤单细胞空间基因表达分析揭示包含出芽细胞的细胞簇具有独特的空间分布

接下来，研究人员将重点转向结直肠腺癌组织，特别关注具有不同肿瘤出芽密度的侵袭前沿区域。通过pan-cytokeratin免疫荧光染色可视化癌细胞，显示了大片癌细胞区域和出芽细胞。细胞识别和聚类分析确定了9个主要细胞簇，包括5个癌细胞簇和4个肿瘤微环境细胞簇（CAFs、T细胞、B细胞/浆细胞和巨噬细胞）。值得注意的是，包含大多数出芽细胞的癌细胞簇（如"癌细胞4"）显示出截然不同的空间分布模式，其细胞分散在主要癌块周围，形成出芽结构。

基因表达分析显示，这些出芽细胞簇中的上皮标志物（EPCAM、CDH1和PIGR）显著下调，而间质标志物（VIM、LUM和FN1）显著上调。通过使用已发表的EMT特征基因集进行评分，进一步证实了"癌细胞4"簇处于间质状态，而其他癌细胞簇则处于上皮样或混合状态。这一发现在其他具有不同肿瘤出芽密度的视野中也得到了验证，表明包含大多数出芽细胞的独特癌细胞簇正在经历EMT。

早期出芽的基因特征与无病生存期相关

为了定义早期出芽细胞的分子特征，研究人员重点研究了FOV1中的"癌细胞4"簇。通过提取相对于所有其他癌细胞簇（61个基因）和CAF簇（206个基因）表达水平更高的基因列表，发现了11个共享基因（TYK2、IL2RG、KRT17、HLA-B、NPPC、WIF1、IL32、B2M、CCND1、CRIP1、ITGB1）。这些基因在"癌细胞4"簇中高度富集，在其他具有不同肿瘤出芽密度的视野中，这一基因特征也在包含大多数出芽细胞的癌细胞簇中强烈富集。

通过分析DSP数据集，发现这11个基因中有7个在侵袭前沿相对于肿瘤中心部分表达更高。在TCGA数据集中，这些基因在结肠腺癌中的平均表达高于相邻正常组织，并且与较差的无病生存期显著相关。单细胞RNA测序数据集分析进一步证实了这一基因特征在经历EMT的癌细胞中表达更高，并且在晚期肿瘤（T3和T4）中比早期肿瘤（T1和T2）表达更高。蛋白质水平分析显示，在侵袭前沿区域和出芽细胞中染色强度更高。功能实验表明，ITGB1基因沉默降低了Caco-2细胞的迁移能力。

高、中、低密度出芽区域的个体视野共享上调和下调基因

通过比较每个视野中包含大多数出芽细胞的癌细胞簇与所有其他癌细胞之间的差异基因表达，研究人员发现不同出芽密度区域之间存在共同的转录组特征。在两个高密度出芽（HDB）视野中，有129个基因共同显著上调，其中前10个最上调基因中有7个是共享的（TYK2、COL1A1、COL3A1、FN1、KRT8、MZT2A和MT2A）。在中密度出芽（MDB）区域，有36个基因共同上调；在低密度出芽（LDB）区域，有79个基因共同上调。

高、中、低密度出芽区域的基因集富集分析显示出芽细胞对周围基质的逐步适应

对HDB区域共同上调的129个基因进行富集分析，揭示了与"赋予抗张强度的细胞外基质成分"和"整合素和胶原结合"相关的分子功能，突出了这些细胞与周围基质的主动相互作用。同时发现许多与"发育过程激活"相关的顶级条目，如"TGF beta"和"IL-4和IL-13信号传导"，这些都被描述为有助于转移播散支持性微环境的生成。"TROP2"和"CKAP4信号通路"也是这些细胞中最高调的通路之一，已知它们在前转移中发挥作用。

对MDB区域36个共同上调基因的类似分析揭示了与HDB区域相同的许多分子功能。此外还发现了"PDGF通路"，表明PDGF信号在CAF激活和ECM重构中发挥关键作用，从而生成促迁移微环境。Reactome数据库中最显著的通路是"胶原降解"，顶级生物过程与"内胚层形成"、"原肠胚形成"和"ECM组织"相关。

对LDB区域79个共同上调基因的分析揭示了免疫防御反应的激活，表现为与MHC II类蛋白复合物相关的分子功能。顶级生物过程也与免疫系统相关，Reactome数据库中最显著的通路是"ECM蛋白聚糖"，这一条目也在HDB和MDB区域中发现。

来自出芽簇的癌细胞经常与CAFs接触

观察到包含大多数出芽细胞的独特癌细胞簇显示出独特的空间分布，其个体细胞与TME中的细胞接触，研究人员调查了它们邻近细胞的性质。发现这些出芽癌细胞比任何其他癌细胞簇的细胞更经常与CAFs接触。在TME中的不同细胞类型中，CAFs是14个视野中9个的最常见接触伙伴。在其余5个视野中，T细胞是两个视野中最常见的接触伙伴，巨噬细胞在两个视野中，基底细胞在一个视野中。

与CAFs接触的癌细胞改变ECM组成以促进迁移和避免凋亡

为了更好地理解CAFs的作用，研究人员比较了与CAFs接触的癌细胞和未接触的癌细胞的基因表达谱。基因集富集分析表明ECM组织发生广泛变化，这可能是由癌细胞和CAFs之间的相互作用影响的。事实上，与CAFs接触的癌细胞显示出比未接触细胞更高的ECM组织评分，在11个视野中的10个观察到这一现象，其中HDB区域的水平最高。同样，在分析胶原ECM评分时也观察到这一现象。此外，在11个视野中的8个，与CAFs接触的癌细胞中观察到更高的粘着斑水平，其中HDB区域的水平最高。而且，在11个视野中的9个， specifically对于与CAFs接触的癌细胞，观察到凋亡过程的下调。

之前的基因集富集分析强调了"ECM和膜受体中的miRNA靶标"作为与所有其他癌细胞簇相比，在包含大多数出芽细胞的癌细胞簇中通常激活的条目。因此，研究人员假设这些基因在与CAFs接触的癌细胞中更活跃。事实上，在LBD区域的所有视野中都观察到了这一点，然而在MDB或HDB区域中这种效应不太明显。

讨论与结论

这项研究通过先进的空间分子成像技术，深入揭示了结直肠癌侵袭前沿出芽癌细胞的形成机制。研究发现，包含大多数出芽细胞的癌细胞簇正在经历上皮-间质转化，表现出独特的空间分布模式，并且经常与癌症相关成纤维细胞接触。研究人员鉴定出了一个由11个基因组成的特征谱（TYK2、IL2RG、KRT17、HLA-B、NPPC、WIF1、IL32、B2M、CCND1、CRIP1、ITGB1），这一特征谱在出芽细胞中高度富集，并且与较差的患者预后相关。

特别重要的是，研究发现癌症相关成纤维细胞在促进癌细胞转移过程中扮演关键角色。与CAFs接触的癌细胞表现出ECM组织、胶原ECM和粘着斑评分的增加，以及凋亡过程的减少，表明CAFs通过改变ECM组成和保护癌细胞免于凋亡来促进迁移。

不同出芽密度区域的比较分析揭示了出芽细胞对周围基质的逐步适应过程：在低密度出芽区域，细胞激活防御反应和MHC II类分子；在中密度出芽区域，增加蛋白酶结合、基质收缩和组织发育相关通路的上调；在高密度出芽区域，ECM配置的进一步变化与PDGF和TGF beta信号通路的激活同时发生。

这些发现不仅增进了对结直肠癌转移机制的理解，而且为开发新的预后标志物和治疗策略提供了重要线索。特别是11基因特征谱可能作为评估患者转移风险和预后的生物标志物，而针对这些基因或CAF与癌细胞相互作用的治疗策略可能为抑制结直肠癌转移提供新途径。

该研究的创新之处在于整合了多种空间转录组学技术，能够在保留空间位置信息的同时分析基因表达，为了解肿瘤微环境中细胞间的相互作用提供了独特视角。研究结果强调了肿瘤微环境，特别是癌症相关成纤维细胞，在癌症转移中的关键作用，为未来研究指明了方向。