尿液食物摄入生物标志物高通量定量方法的开发与验证：基于HPLC-MS/MS同步检测80种标志物评估27种食物

本刊推荐：为解决营养研究中传统膳食评估方法存在系统误差和准确性不足的问题，研究人员开展了针对多种食物摄入生物标志物(BFIs)的同步定量方法开发与验证研究。该研究成功建立了同时定量尿液中80种BFIs（反映27种食物摄入）的HPLC-MS/MS方法，包含简单样品前处理程序和6分钟色谱分离。验证结果显示44种BFIs可实现绝对定量，36种需半定量测定。该方法为大规模营养研究提供了可靠分析工具，显著提升膳食评估的客观性和准确性。

　　

在营养学与健康研究领域，准确评估个体膳食摄入量始终是一个核心挑战。传统依赖自我报告的膳食调查方法，如食物频率问卷和24小时回顾法，虽被广泛应用，但容易受到记忆偏差、社会期望效应和估测误差等多种因素影响，导致数据存在显著的系统误差和随机误差。这种"测不准"的困境严重制约了研究人员精确探究饮食与健康关系的能力。

为突破这一瓶颈，科学家们将目光投向生物标志物(Biomarkers of Food Intake, BFIs)——这些存在于生物样本(如血液、尿液)中，能客观反映特定食物摄入的化合物。BFIs作为膳食摄入的"客观证人"，有望弥补传统方法的不足，提高膳食评估的准确性，甚至在干预研究中监测受试者的依从性。近年来，随着代谢组学技术的发展，大量潜在的BFIs被发现和鉴定。然而，从发现到应用仍存在巨大鸿沟：绝大多数BFIs候选物仅经过部分验证，缺乏经过全面验证的、可靠的定量方法；且现有分析方法通常每次只能覆盖少量BFIs，无法满足实际研究中需要同时评估多种食物摄入的需求。

针对这一方法论缺口，由Christoph Hassenberg、Sebastian T. Soukup和Carina I. Mack等来自德国马克斯·鲁布纳研究所(Max Rubner-Institut)的研究团队开展了一项创新性研究，致力于开发并验证一种能够同步定量尿液中多种BFIs的高通量分析方法。他们的研究成果发表在《Journal of Chromatography B》上，为营养学研究提供了强有力的分析工具。

研究人员采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术平台，结合C18柱和亲水相互作用色谱(HILIC)柱两种分离模式，分别在正负离子模式下进行检测。方法采用简单的"稀释-进样"(dilute-and-shoot)样品前处理流程，单个样品总分析时间约30分钟。关键技术特征包括：使用计划多反应监测(scheduled Multiple Reaction Monitoring, sMRM)提高检测效率；针对86种分析物优化质谱参数；通过干预研究样本确定各分析物的生理相关工作范围；采用精心设计的内标策略(15种同位素标记内标物)校正基质效应。

研究样本来源于一项非随机、非盲法的营养干预研究，该研究招募15名健康参与者(11名女性，4名男性)，年龄22-40岁，BMI范围19.0-30.1 kg/m²。研究通过伦理委员会批准(#F-2021-175)并在德国临床试验注册中心注册(DRKS00029266)。参与者食用与所选BFIs相关的所有食物，提供受控的空白样本用于方法验证。

3.1. Method development

方法开发过程中，研究人员为每种分析物优化了两个最合适的MRM转换通道作为定量和定性离子。86种分析物中，56种使用C18柱分析，30种使用HILIC柱分析。由于色谱行为问题，最终排除了甲醇丁香酚、木糖、茶氨酸、氢醌硫酸盐和乙基葡萄糖醛酸等6种分析物。C18和HILIC色谱的正交分离特性确保了所有分析物在各自柱上有足够保留，与进样峰分离良好，最大程度减少了潜在基质效应。

3.2. Method validation

方法验证参照欧洲药品管理局(EMA)、美国食品药品监督管理局(FDA)和SANTE指南进行，但根据多靶点分析的特点适当调整了接受标准。验证参数包括选择性、线性、基质效应、提取回收率、日内日间准确度和精密度。

线性验证显示，78种分析物呈现良好线性关系(R²>0.99)，仅2-硫代噻唑烷-4-羧酸、沙索林醇、乙酰肉碱和三甲胺-N-氧化物显示线性不足。回收率评估表明大多数分析物在86%-116%范围内，RSD一般<20%。基质效应评估显示48%、46%和50%的分析物在低、中、高浓度水平满足SANTE的±20%标准。准确度和精密度验证显示，随着浓度水平提高，满足严格标准的分析物比例增加：日内准确度在LLOQ、低、中、高浓度水平分别有57%、66%、65%和76%的分析物满足标准；日间准确度则分别为41%、58%、67%和63%。

3.2.3.1. Pseudo-MRMs and detection in urine sample

对于某些无法获得参考标准的II相代谢物BFIs(如根皮素葡萄糖醛酸、苍术苷元葡萄糖醛酸等)，研究人员通过检测其裂解形式进行间接定量。这些代谢物在尿样中显示出可接受的精密度(7%-21%)，但由于缺乏参考标准，只能进行半定量测定。

最终验证结果显示，80种BFIs中，44种可无限制绝对定量，20种在低浓度有限制但仍可定量，16种因验证数据存在不确定性而只能半定量测定。这些BFIs代表27种欧洲常见食物(24种植物性和3种动物性)，其中6种食物只能通过半定量BFIs评估。

4. Discussion

本研究开发的方法专为满足大样本集分析需求而设计，非常适合大规模队列研究应用。大多数分析物除低浓度外可无限制定量，部分BFIs因缺乏空白基质和/或空白水平较高而只能半定量测定。与以往方法相比，本研究方法覆盖食物种类更多(27种)，且工作范围基于干预研究中实际摄入量确定的生理相关浓度，更符合自由生活条件下的实际情况。

内标策略面临挑战：由于许多标记标准品商业不可得，无法为所有分析物配备同位素标记内标。这导致某些分析物(如柑橘类水果标志物脯氨酸甜菜碱和羟脯氨酸甜菜碱)的基质效应无法充分补偿，影响定量准确性。此外，分析内源性化合物或常见食物来源物质时缺乏真实空白样本，是此类方法验证的共同挑战。

尽管存在这些限制，该方法仍为BFIs定量提供了宝贵基础。取决于具体研究目的，某些偏差在定义条件下是可接受的：对于监测膳食依从性，半定量数据可能足够；对于摄入排序和平均差异比较，半定量数据可能同样充分；但对于定量膳食摄入评估，则需要精确量化。

5. Conclusion

本研究开发的HPLC-MS/MS方法为27种广泛消费的动植物源性食物BFIs定量提供了稳健高效的分析工具。27种食物中，21种可绝对定量，其余6种可半定量测定。该方法包含根据实际习惯摄入量确定的生理相关浓度范围的分析物特异性工作范围，并通过验证证实了其可靠性。尽管当前设置已表现出高效分析性能，仍可通过添加新近识别的BFIs、使用合适同位素标记内标物、使用专用空白基质或色谱方法调整来进一步改进。

下一步工作是将此定量多BFI方法应用于更大规模的队列研究，证明其在营养学研究中常规应用的适用性。该方法为增强膳食评估提供了互补工具，有望推动BFI定量与营养学研究的整合。同时，多种BFIs的同步定量将产生有价值的新验证数据，进一步加强所含生物标志物的证据基础。

这项研究代表了膳食评估方法论的重要进展，为营养流行病学和临床研究提供了更加客观、准确的工具，最终将促进我们对饮食与健康关系的深入理解。