平滑肌ADAR1介导的RNA编辑通过抑制MDA5感知通路调控动脉粥样硬化发生的新机制

本研究揭示了RNA编辑酶ADAR1在血管平滑肌细胞中的特异性功能，通过编辑免疫原性双链RNA抑制MDA5感应器激活，从而维持血管稳态。研究人员利用条件性基因敲除模型、单细胞测序和人类斑块分析，证实ADAR1-MDA5轴调控平滑肌细胞表型转换、炎症反应和钙化过程，为冠状动脉疾病提供了新的治疗靶点。该发现不仅阐明了遗传风险变异影响疾病进展的分子机制，也为干预ISG信号通路提供了理论依据。

　　

在心血管疾病研究领域，冠状动脉疾病（CAD）始终是全球死亡的首要原因。尽管全基因组关联研究（GWAS）已发现数百个CAD相关基因位点，但除降脂疗法外，基于这些发现的治疗进展仍然有限。表达数量性状位点（eQTL）分析将遗传变异与转录调控联系起来，但转录后机制，尤其是RNA编辑，在疾病中的作用尚未被充分探索。A-to-I RNA编辑由ADAR酶催化，是一种进化上保守的过程，广泛影响RNA序列、转录本功能、RNA稳定性和免疫原性。近年来研究发现，降低A-to-I RNA编辑的常见变异（编辑QTLs，edQTLs）会增加CAD风险，表明遗传编码的RNA编辑能力在CAD中具有因果作用，但其生物学机制尚未明确。

ADAR1主要编辑重复元件中的双链RNA（dsRNA），防止其被先天免疫传感器识别。值得注意的是，ADAR1抑制胞质dsRNA传感器MDA5（由IFIH1编码），在小鼠中，Adar缺失会因MDA5依赖性激活干扰素刺激基因（ISG）程序而导致胚胎致死。在人类中，ADAR的功能缺失变异或IFIH1的功能获得变异会导致以早发性血管钙化为特征的孟德尔干扰素病（如Aicardi-Goutières和Singleton-Merton综合征），这将ADAR1-dsRNA-MDA5轴与血管疾病联系起来。尽管先前研究通过转录本特异性编辑（如NEAT1和CTSS）暗示ADAR1在动脉粥样硬化中的作用，但遗传和分子数据越来越支持一个更广泛的模型，即ADAR1介导的免疫原性dsRNA编辑控制MDA5激活，作为动脉粥样硬化形成的机制。支持这一假设的是，IFIH1（MDA5）的功能缺失变异对CAD具有保护作用，并且IFIH1位点在CAD GWAS中达到全基因组显著性。

为了深入探究ADAR1介导的RNA编辑在血管平滑肌细胞（SMCs）中如何调控MDA5激活和动脉粥样硬化进展，研究人员开展了一系列实验。通过人类单细胞转录组学、体外建模、条件性SMC特异性Adar敲除（KO）小鼠以及附加Ifih1缺失和人类斑块转录组学分析，他们发现平滑肌特异性的ADAR1-dsRNA-MDA5轴是调控SMC状态、炎症、钙化和CAD风险的关键调节器。这项工作定义了连接人类遗传学和血管生物学的机制和治疗范式。

本研究主要应用了多种关键技术方法：利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析人类颈动脉粥样硬化斑块和小鼠模型中的细胞组成和基因表达；通过siRNA敲低（KD）技术在人类冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）中进行ADAR1、IFIH1和PKR的功能研究；构建条件性平滑肌细胞特异性Adar基因敲除小鼠模型（Myh11-CreERT2; Adar^fl/fl; Rosa^tdTomato; Apoe^-/-），并结合Ifih1缺失模型；使用RNAscope进行原位基因表达验证；采用组织学染色（如H&E、Masson三色、Ferangi Blue钙染色）和免疫组化分析斑块特征；通过体外钙化模型研究平滑肌细胞成骨分化；应用生物信息学分析（包括差异表达分析、轨迹分析、细胞通讯分析）解析测序数据；最后利用Athero-Express人类颈动脉内膜切除队列进行临床相关性分析。

Expression of immunogenic RNA within vascular SMCs in human atherosclerotic plaques

研究人员通过分析人类颈动脉粥样硬化斑块的scRNA-seq数据，发现平滑肌细胞（SMCs）相对于其他血管、免疫和基质细胞类型，显著富集免疫原性RNA的表达。他们使用629个高置信度的人类转录本列表（这些转录本预测会形成需要A-to-I编辑的dsRNA结构）计算模块评分，结果显示SMCs中这些免疫原性转录本的表达水平最高，表明SMCs可能特别依赖RNA编辑来维持免疫耐受。

SMC phenotypic modulation and ISG induction in atherosclerosis

在动脉粥样硬化中，SMCs经历表型调节（phenotypic modulation），去分化为纤维肌细胞（FMC）和软骨肌细胞（CMC）。通过对人类斑块数据的SMCs亚群分析，研究人员发现最调节化的SMC群（cluster 0）强烈上调ISGs（如ISG15、IFI35和IFI16）。小鼠模型中也观察到类似现象，Myh11下调而Col2a1上调，表明随着SMCs表型转变，它们激活了细胞固有的ISG反应，可能反映了通过MDA5感知dsRNA。

ADAR1 loss in HCASMCs activates MDA5 and ISGs in vitro

在人类冠状动脉平滑肌细胞（HCASMCs）中，ADAR1敲低（KD）导致MDA5（IFIH1）和多个ISGs（如ISG15、OAS1、MX1）的显著上调，且这一效应依赖于MDA5。血清刺激增强了ADAR KD诱导的ISG激活，而IFIH1共敲低可逆转此效应。此外，与CAD和SMC表型相关的转录因子（KLF4、EGR1、ATF3）也以MDA5依赖性方式上调。KEGG分析显示"TNF signaling"、"influenza A"和"lipid and atherosclerosis"通路富集。

Global RNA editing is decreased in HCASMCs following phenotypic modulation in vitro

在对照组siRNA处理的HCASMCs中，血清刺激导致数百个位点的编辑频率广泛降低。ADAR KD产生更大效应，在ADAR和IFIH1双敲低细胞中，无论在血清饥饿还是血清刺激条件下，均观察到多个位点的编辑显著丢失。血清刺激改变了82%的免疫原性RNA的表达，但总表达量不变；而ADAR KD在血清刺激期间以MDA5依赖性方式降低了免疫原性RNA的总表达。

TGFβ attenuates MDA5 and ISG activation in HCASMCs

TGFβ处理减弱了ADAR KD诱导的ISG15上调（从25倍降至10倍以下），这一效应被IFIH1 KD阻断，并被PKR（EIF2AK2）KD减弱。TGFβ同样降低了IFIH1和EIF2AK2的表达。SMAD3 KD降低了ADAR KD诱导的ISG15和IFIH1表达，但TGFβ的抑制作用仍然存在，表明非经典TGFβ信号参与其中。TGFβ轻微上调ADAR，而ADAR水平在8天后通过IFIH1而非EIF2AK2恢复正常，提示MDA5介导的反馈。

ADAR1 and MDA5 regulate the transcriptomic and inflammatory response to calcification in vitro

在钙化培养基中，ADAR KD导致HCASMCs钙沉积增加和细胞死亡，而IFIH1共敲低可逆转此效应。RNA-seq显示，钙化培养基在scramble siRNA处理下促进骨形态发生蛋白相关信号基因（如FBLN5、FMOD、RANBP3L）上调，但ADAR KD以MDA5依赖性方式减弱了这一效应。虽然钙化本身未广泛激活ISGs，但ADAR KD使细胞在促钙化培养基中敏感到促炎程序（涉及NFKB1、JUND、MMP1、MMP10），且依赖于IFIH1。

SMC-specific Adar maintains vascular integrity and survival in vivo

SMC特异性Adar纯合缺失小鼠（SMC-Adar^-/-）在他莫昔芬诱导后迅速出现体重减轻、毛发竖立和弓背姿势，50%在14天内死亡。尸检显示主动脉红斑和瘀点，组织学可见弹性板层破坏、基质分离和壁内出血。荧光成像显示沿外膜的tdTomato⁺ SMCs丢失伴血管壁气球样变。CD68染色显示巨噬细胞浸润，Masson三色染色指示膜内纤维化。这些结果表明SMC ADAR1对血管稳态和生存至关重要。

Haploinsufficiency of MDA5 is sufficient to protect against mortality in SMC-Adar^-/- mice

MDA5杂合缺失（SMC-Adar^-/- + Ifih1^+/-）完全防止了SMC-Adar^-/-小鼠的死亡和疾病表型，而MDA5纯合缺失（SMC-Adar^-/- + Ifih1^-/-）提供进一步保护。组织学分析显示，MDA5杂合缺失足以防止血管完整性丧失、炎症和纤维化。RT-qPCR显示ISG诱导被MDA5杂合缺失完全阻断，表明MDA5单倍剂量不足足以抑制ADAR1缺失的表型。

SMC Adar deletion drives ISG activation, phenotypic transition and macrophage recruitment

scRNA-seq显示，SMC-Adar^-/-小鼠出现两个新的SMC簇（SMC_cAdar1_KD1和KD2），高表达ISGs（如Isg15、Ccl5、Cxcl10）和低表达收缩标志物（如Cnn1、Myh11）。这些簇也表达Sca1（Ly6a），表明部分去分化。还观察到浸润巨噬细胞（Mac.2）和细胞毒性T细胞，但经典I型干扰素（Ifna1、Ifnb1）和Il6表达极少，提示ISG激活通过MDA5而非细胞因子信号。受体-配体分析表明SMC簇是CCL5信号的主要发送者，通过CCL5-CCR5与巨噬细胞和T细胞通讯。

Homozygous deletion of Ifih1 prevents transcriptomic effects of SMC-Adar^-/-

SMC-Adar^-/- + Ifih1^-/-小鼠的scRNA-seq谱与对照组几乎 identical，缺乏浸润巨噬细胞、T细胞和Sca1^hi成纤维细胞。ISG诱导（如Isg15、Ccl5）在所有细胞类型中被完全消除，收缩SMC标志物（Myh11、Cnn1）保留。全局基因表达谱在对照组和双KO小鼠间几乎相同，表明SMC-Adar^-/-的大部分效应是MDA5激活的次级效应。一小部分基因在两种KO中均下调，提示ADAR1的MDA5非依赖性作用，而另一部分显示相反调控，提示MDA5的潜在ADAR1非依赖性效应。

SMC-specific haploinsufficiency of Adar activates the ISG response in atherosclerosis and increases vascular chondromyocyte formation

SMC-Adar^+/-小鼠在高脂饮食16周后，scRNA-seq显示ISG表达SMC簇（SMC_ISG）显著扩增（24.7% vs 11%），高表达Isg15、Ifit3、Irf7和Ifih1。SMCs经历表型调节，收缩标志物下调，FMC/CMC标志物（如Tnfrsf11b、Col2a1、Acan）上调，且SMC_ISG簇处于收缩和调节状态之间的中间位置。CMC标志物（如Col2a1、Acan）在SMC-Adar^+/-小鼠中上调，CMC比例增加（22.6% vs 16.3%）。

Lineage trajectory analysis of vascular chondrogenesis reveals a distinct ISG-dependent trajectory

对tdTomato⁺细胞的高分辨率簇轨迹分析揭示了两条独立的CMC形成路径：一条直接从FMCs进行，另一条通过富含ISG的SMC_ISG簇。ISG依赖路径特征性地依次上调Isg15、Irf7、Ly6a，并最终上调CMC标志物（如Col2a1、Chad、Spp1）。富集通路包括病毒感知、JAK-STAT信号和黏着斑重塑，提示ISG驱动信号在CMC分化中的作用。RNAscope证实Isg15在SMC-Adar^+/-小鼠的血管中层、斑块内和外膜显著富集，但与Col2a1表达CMC空间分离，支持ISG激活先于并促进CMC形成的模型。

SMC-specific haploinsufficiency in Adar increases plaque size and calcification in atherosclerosis

组织学评估显示，SMC-Adar^+/-小鼠比对照组形成更大的动脉粥样硬化斑块，且在校正内弹性膜（IEL）面积后仍显著。中层（IEL至外弹性膜EEL）更薄，提示SMC迁移增加。斑块与中层比率显著更高，向外重塑（EEL面积）也增加。Ferangi Blue染色显示SMC-Adar^+/-小鼠钙化总面积显著更大，且在校正斑块大小后仍显著。这些结果表明SMC特异性Adar单倍剂量不足加速血管钙化和斑块进展。

SMC-specific haploinsufficiency of Adar increases SMC lineage-traced cell content in plaques

SMC-Adar^+/-小鼠斑块内tdTomato⁺面积显著更大，但纤维帽中无显著增加。Masson三色染色显示基因型间无细胞（坏死）斑块面积无显著差异，表明SMC含量增加未导致 exaggerated plaque necrosis。

SMC-specific haploinsufficiency in Adar has minimal effect on macrophage content in atherosclerosis

scRNA-seq显示非tdTomato⁺细胞中巨噬细胞比例略有增加（39.7% vs 35.2%），但CellChat受体-配体分析未检测到来自SMC_ISG群体的CCL信号。斑块内CD68⁺面积略有增加，但校正斑块面积或血管总面积后仅呈趋势，缺乏主要效应，可能与SMC Adar基因缺失、MDA5激活和Ccl5表达的"剂量依赖性"反应有关。

Haploinsufficiency of Ifih1 prevents ISG activation and CMC formation in atherosclerosis in SMC-Adar^+/- mice

SMC-Adar^+/- + Ifih1^+/-小鼠的scRNA-seq显示ISG激活被完全阻止，SMC_ISG簇消失。CMC标志物（Col2a1、Acan）表达降低，CMC比例减少至对照组水平。基因表达热图显示ISG和FMC/CMC标记在双杂合小鼠中恢复正常，表明MDA5单倍剂量不足足以防止SMC-Adar^+/-的转录组和表型效应。

Interferon-stimulated gene expression in human atherosclerotic plaques correlates with SMC modulation, plaque vulnerability and calcification

分析Athero-Express人类颈动脉内膜切除队列，发现ISG表达与SMC表型调节标志物（LUM、HAPLN1）呈正相关，与收缩SMC标志物（ACTA2）呈负相关。ISG表达与斑块易损性指数正相关，与钙化面积正相关，但与巨噬细胞含量无显著关联。多变量线性回归校正混杂因素后，这些关联仍然显著，表明ISG表达与人类斑块不稳定性、钙化和SMC调节直接相关。

本研究通过整合人类遗传学、分子生物学和动物模型，揭示了ADAR1-MDA5轴在动脉粥样硬化中的核心作用。研究发现平滑肌细胞特异性ADAR1缺失会激活MDA5依赖的ISG反应，驱动SMC表型转换、炎症和钙化，最终导致斑块不稳定和疾病进展。人类数据进一步证实ISG表达与斑块易损性和钙化正相关，为CAD提供了新的机制见解和治疗靶点。这些发现不仅阐明了RNA编辑在心血管疾病中的重要性，也为开发针对dsRNA感知通路的疗法奠定了理论基础。