CRISPR编辑iPSC揭示BSN基因突变通过星形胶质细胞脂质积累诱导神经元超兴奋性

本研究针对BSN基因突变导致癫痫的机制不明问题，通过CRISPR/Cas9技术构建人iPSC模型，发现突变型星形胶质细胞出现脂质代谢紊乱（APOE/FASN上调）、Kir4.1通道功能受损及神经元超兴奋性。揭示了星形胶质细胞脂质稳态在癫痫发生中的关键作用，为靶向脂质代谢的治疗策略提供了新依据。

　　

在当今社会，癫痫作为一种常见的神经系统疾病，影响着全球约5000万人的生活质量。这种疾病的特点是反复发作的癫痫发作，给患者及其家庭带来了巨大的负担。尽管科学家们已经发现许多基因突变与癫痫有关，但具体的发病机制，尤其是这些突变如何影响非神经元细胞（如星形胶质细胞）的功能，仍然是一个未解之谜。其中，BSN基因的突变近年来引起了研究人员的广泛关注。BSN基因编码的Bassoon蛋白是突触前活性区的重要支架蛋白，参与神经递质的释放。然而，BSN突变如何导致癫痫，特别是其对星形胶质细胞的影响，尚不清楚。

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞，它们在维持脑内稳态和调节神经元活动中扮演着关键角色。近年来的研究表明，星形胶质细胞在癫痫中起着重要作用，尤其是脂质代谢的紊乱可能与疾病的发生和发展密切相关。脂质在维持细胞膜完整性、信号转导和能量代谢中至关重要。星形胶质细胞脂质代谢的失调可能会破坏神经元与胶质细胞之间的相互作用，改变突触传递，并最终导致神经元超兴奋性和癫痫发作。尽管有这些发现，但BSN基因突变如何影响星形胶质细胞的脂质代谢，以及这一过程如何促进癫痫的发生，仍然是一个有待探索的领域。

为了深入探究这一问题，研究人员利用近年来迅速发展的诱导多能干细胞（iPSC）技术和CRISPR/Cas9基因组编辑技术，构建了携带患者来源的BSN突变（p.M1903V和c.5672insCG）的人iPSC模型。通过这些模型，研究人员能够模拟癫痫的遗传基础，并在体外研究BSN突变对星形胶质细胞功能和神经元活动的影响。他们的研究发现，BSN突变会导致星形胶质细胞脂质积累，进而引起神经元超兴奋性。这一发现不仅揭示了BSN突变导致癫痫的新机制，还强调了星形胶质细胞脂质代谢在癫痫发病中的重要性，为开发新的治疗策略提供了潜在靶点。相关研究成果发表在《Neurotherapeutics》上，为癫痫研究领域带来了新的突破。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9技术构建BSN突变（包括杂合和纯合突变）的人iPSC模型；通过蛋白质组学分析筛选差异表达蛋白并进行KEGG通路富集分析；使用电生理记录技术检测星形胶质细胞的膜电位和Kir4.1通道功能；通过细胞共培养体系评估星形胶质细胞对神经元功能的影响；采用脂质代谢相关 assays（如游离胆固醇测量、油红O染色）分析脂质积累情况。所有细胞模型均来源于商业获得的人iPSC系（iPSN0077）。

研究结果部分如下：

Generation and validation of BSN-mutant iPSCs

通过CRISPR/Cas9技术成功构建了三种BSN突变型iPSC（BSN^5672insCG/wt、BSN^M1903V/wt和BSN^{M1903V/M1903V}），并经测序验证。突变型iPSC保持多能性标志物表达和三胚层分化能力，核型分析和脱靶效应检测确认模型可靠性。

Differentiation of BSN-mutant iPSCs into neural stem cells (NSCs)

突变型iPSC可分化为神经干细胞（NSC），表达SOX1和Nestin标志物。外泌体形态和内化能力无显著差异，但BSN^5672insCG/wt和BSN^{M1903V/M1903V} NSC增殖能力显著降低。

Proteomic analysis reveals dysregulated lipid metabolism in BSN-mutant NSCs

蛋白质组学分析发现突变型NSC中脂质代谢相关蛋白（如APOE、APOB、FASN）显著上调，KEGG富集分析提示胆固醇代谢通路紊乱。

Lipid accumulation and metabolic dysregulation in BSN-mutant astrocytes

突变型星形胶质细胞在红藻氨酸（KA）刺激后出现游离胆固醇升高、精氨酸酶活性降低和脂滴积累，其中BSN^5672insCG/wt表型最严重。

BSN-mutant astrocytes exhibit significant membrane depolarization, indicative of impaired ionic homeostasis

电生理记录显示突变型星形胶质细胞在KA刺激后静息膜电位去极化、Kir4.1电流密度降低且细胞电容增加，同时伴有ERK/CREB磷酸化增强和EAAT2/Kir4.1/GS表达下降。

BSN-mutant astrocytes induce neuronal dysfunction and apoptosis

与突变型星形胶质细胞共培养的神经元出现突触减少（PSD95染色）、炎症因子（IL-1β、TNF-α）升高、凋亡增加（Bax/Caspase-3上调）及动作电位频率/振幅异常。

研究结论与讨论部分指出：BSN基因突变通过破坏星形胶质细胞脂质稳态（表现为APOE/FASN上调、胆固醇积累和精氨酸酶活性抑制），导致Kir4.1通道功能障碍和神经元超兴奋性。这一非神经元机制补充了BSN在突触前功能的传统认知，揭示了癫痫发生中脂质-神经炎症-离子稳态的恶性循环。研究首次在人类iPSC模型中证实星形胶质细胞表达的BSN具有生理功能，为靶向脂质代谢（如APOE调节剂或ERK抑制剂）的癫痫治疗提供了新方向。未来需在患者来源iPSC和体内模型中进一步验证靶点特异性。