NF-κB/STAT6信号通路介导的肾上腺髓质素（ADM）促进成体心脏纤维细胞增强梗死后淋巴管新生与心脏修复

本研究针对心肌梗死（MI）后心脏修复难题，探讨了成人心脏纤维细胞（aCFs）经细胞因子（CKs）诱导后通过NF-κB/STAT6信号通路表达VCAM1，形成具有淋巴管生成潜能的aVCFs亚群。研究发现aVCFs通过分泌肾上腺髓质素（ADM）促进淋巴管内皮细胞增殖与迁移，显著改善心脏功能并减少纤维化，为自体细胞治疗缺血性心力衰竭提供了新策略。

　　

心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，尽管再灌注治疗在超急性期能有效阻止心肌坏死，但患者整体预后仍不理想。心肌梗死后不可逆的梗死瘢痕和心功能永久性丧失，直接导致预后恶化及生活质量下降。近年来，心脏淋巴管系统在生理和病理过程中的作用逐渐被揭示，尤其是治疗性淋巴管新生（Therapeutic Lymphangiogenesis）被认为是一种治疗缺血性心脏病的新途径。已有研究表明，施用血管内皮生长因子-C（VEGF-C）可促进心脏淋巴管新生，从而缓解组织水肿和炎症，减少梗死灶并改善心脏保护作用。此外，肾上腺髓质素（Adrenomedullin, ADM）也被证实能诱导修复性心脏淋巴管新生并改善心肌水肿。

然而，干细胞移植等再生医学策略虽能通过替代丢失的心肌组织、发挥抗凋亡、抗炎和/或促血管生成作用来提供心脏保护，但免疫原性和伦理问题限制了其应用。心脏纤维细胞（Cardiac Fibroblasts, CFs）作为异质性细胞群体，在心肌梗死后的修复机制中扮演重要角色。研究团队此前发现，表达血管细胞黏附分子1（VCAM1）的人胎儿心脏纤维细胞（fCFs）特定群体具有心脏保护作用，能诱导修复性心脏淋巴管新生。但使用fCFs进行同种异体移植存在免疫原性和伦理问题，且尚不清楚成人心脏纤维细胞（aCFs）是否具有与fCFs相似的促淋巴管生成特性，而aCFs在临床实践中更适用于自体移植。

为此，研究人员开展本研究，旨在探究aCFs在表面标志物表达和促淋巴管生成潜力方面与fCFs的差异，并测试aCFs是否可通过外源性 manipulation 获得fCFs样的淋巴管生成潜力，从而作为治疗心肌梗死及相关心力衰竭的细胞疗法。

研究团队通过体内心肌梗死模型（大鼠和小鼠）以及体外与淋巴管内皮细胞（Lymphatic Endothelial Cells, LECs）的共培养实验，发现肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-4（IL-4）刺激能通过核因子-κB（NF-κB）和信号转导与转录激活因子6（STAT6）信号通路诱导aCFs表达VCAM1，产生一个称为成人VCAM1+心脏纤维细胞（aVCFs）的亚群。这些aVCFs不同于肌纤维母细胞（myofibroblasts），表达CD90并能改善心肌梗死后的心脏功能。进一步机制研究表明，肾上腺髓质素（ADM）是关键旁分泌效应因子，其基因敲低（knockdown）减弱了aVCFs的促淋巴管生成和心脏保护作用。

为开展研究，作者运用了多项关键技术方法：包括从人心室分离培养原代成人心脏纤维细胞（aCFs），通过细胞因子（TNF-α和IL-4）刺激诱导VCAM1表达，并利用流式细胞术（FCM）分选CD90+VCAM1+细胞群体（即aVCFs）；通过RNA测序（RNA-seq）进行基因表达分析，筛选差异表达基因（DEGs）；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和多重蛋白分析（Multiplex）检测候选因子分泌水平；利用小干扰RNA（siRNA）转染进行基因敲低；在体外进行淋巴管内皮细胞增殖（WST-1 assay）和迁移（transwell assay）实验；在体内建立大鼠和小鼠的心肌梗死及缺血再灌注（Ischemia-Reperfusion, IR）损伤模型，并进行细胞移植；通过超声心动图评估心功能，组织学染色（如天狼星红、H&E、免疫荧光）评估纤维化、梗死面积和淋巴管新生；并通过原位杂交（ISH）和定量PCR（qPCR）分析相关基因表达。

研究结果

Heterogeneity of human aCFs

研究人员首先培养了来自人心室的原代aCFs，这些细胞呈现典型的成纤维细胞扁平梭形形态。aCFs几乎不表达心肌细胞或内皮细胞的主要标志物，如心肌肌钙蛋白T（cTnT）、α-辅肌动蛋白（α-actinin）和VE-钙黏蛋白（CD144），排除了心肌细胞或内皮细胞污染的可能。相反，aCFs强阳性表达多种成纤维细胞或肌纤维母细胞特异性标志物，如波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）、盘状结构域受体酪氨酸激酶2（DDR2）和纤连蛋白（fibronectin）。然而，与这些标志物不同，CD90（THY1）的表达呈现明显的双峰分布，且与fCFs中大多数细胞CD90阳性的情况不同。更重要的是，aCFs中CD90+VCAM1+细胞群体几乎不存在（仅1.1±0.77%），与fCFs中的观察结果形成对比。

Mimicking cellular characteristics of aCFs to fCFs

为诱导aCFs表达VCAM1，研究团队用不同浓度TNF-α和IL-4（细胞因子，CKs）组合处理aCFs。发现TNF-α浓度≥1.0 ng/mL时可诱导VCAM1表达，但仅2%的aCFs表达VCAM1。而IL-4与TNF-α联合使用时，VCAM1阳性细胞比例显著增加，且呈IL-4剂量依赖性。最佳诱导条件为50.0 ng/mL TNF-α和2.0 ng/mL IL-4组合。这种CKs处理增加了所有成纤维细胞群体（包括CD90阴性 and CD90阳性亚群）中VCAM1阳性细胞的比例，促进了CD90+VCAM1+活化心脏纤维细胞（aVCFs）的出现。aVCFs的细胞外基质（ECM）刚性、蛋白和基因表达模式与TGF-β1诱导的肌纤维母细胞不同，表明TNF-α/IL-4处理的aCFs构成一个功能 distinct 的成纤维细胞亚型，具有增强的炎症反应性和潜在的更强淋巴管生成能力。

通过荧光报告基因 assay 和荧光素酶报告基因 assay，证实CKs促进了NF-κB和STAT6的核转位及信号通路激活。体外功能实验表明，aVCFs的条件培养基（Conditioned Medium, CM）对淋巴管内皮细胞具有最强的增殖和迁移促进作用。

Lymphangiogenic potential of fCF-like aCFs and their ability to restore cardiac function

在缺血性心力衰竭大鼠模型中，移植aCFs对左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）无治疗作用；移植aCFs+CKs可在移植后10周内改善心功能，但18周时效果下降；而aVCFs治疗组在整个实验期间心功能持续改善，18周时LVEF达61.0±2.2%，LVFS达27.2±1.4%。组织学评估显示，aVCFs治疗组纤维化和梗死面积显著减少。免疫荧光染色发现，aVCFs组Prox-1阳性细胞核数量显著增加，原位杂交显示VEGFR3阳性细胞在aVCFs组最为丰富。这些结果表明，aVCFs通过促进淋巴管新生和减轻局部炎症，长期改善心肌收缩功能并减少纤维化区域。

Identification of paracrine factors involved in the lymphangiogenic effects of aVCFs

通过RNA-seq基因表达分析，筛选出与短期和长期治疗效应相关的候选因子。ELISA和多重分析确定ADM在aVCFs中的表达水平约为aCFs的8倍，且其表达依赖于NF-κB/STAT6信号轴。ADM基因敲低显著破坏了aVCFs与淋巴管内皮细胞共培养时的管腔形成（tube formation），并部分抑制了LECs的增殖和迁移能力。

在同系小鼠模型中，ADM敲低的mVCFs（mVCF siADM）部分取消了其对心脏收缩功能障碍的保护作用，心肌纤维化抑制作用和心脏淋巴管形成促进作用也减弱。此外，VCFs治疗降低了心脏组织中炎症细胞因子TNF-α和IL-1β的表达，并减少了巨噬细胞浸润，表明其抗炎作用至少部分依赖于ADM。

研究结论与意义

本研究成功鉴定出成人心脏纤维细胞中一个具有促淋巴管生成活性的亚群（aVCFs），其特性类似于胎儿心脏纤维细胞（fCFs）。通过TNF-α和IL-4联合刺激，经NF-κB/STAT6信号通路诱导aCFs表达VCAM1，可高效生成aVCFs。aVCFs通过分泌肾上腺髓质素（ADM）促进淋巴管新生，从而在心肌梗死后改善心脏功能、减少纤维化并减轻炎症反应。

该研究的重要意义在于：首先，为自体细胞治疗缺血性心力衰竭提供了新的候选细胞类型，避免了使用胎儿细胞带来的免疫原性和伦理问题；其次，揭示了NF-κB/STAT6信号通路在调控心脏纤维细胞旁分泌功能中的关键作用；第三，明确了ADM作为aVCFs发挥心脏保护效应的核心因子，为开发靶向ADR的治疗策略提供了理论依据；最后，研究结果提示促进心脏淋巴管新生可能成为治疗心肌梗死和心力衰竭的新途径，尤其适用于现有标准治疗（如RAAS抑制剂）无法有效解决心肌水肿的患者群体。

然而，研究也存在一定局限性：例如Prox-1和VEGFR3并非淋巴管内皮细胞特异性标志物（Prox-1也在心肌细胞表达，VEGFR3在心脏巨噬细胞高表达），未来需通过多重标志物免疫染色进一步明确淋巴管新生的贡献；此外，ADM在aCF+CKs中也有显著上调，aVCFs长期疗效优势是否源于ADM表达阈值效应或其他因子参与，尚需深入探索。

总体而言，该研究不仅深化了对心脏纤维细胞异质性和功能多样性的认识，而且为临床转化提供了有前景的细胞治疗策略，发表于《Scientific Reports》的这项工作具有重要的科学价值和潜在临床应用前景。