Phactr4通过调控PP1/GSK3-β通路介导慢性应激诱导的氧化应激与行为障碍

本研究聚焦于慢性应激诱导的抑郁样行为与海马氧化应激损伤的机制，揭示了Phactr4通过结合PP1调控GSK3β磷酸化水平，进而影响Nrf2介导的抗氧化通路，导致氧化应激与神经炎症反应加剧；研究人员通过动物行为学检测、蛋白质组学、分子对接及病毒干预等技术，证实抑制Phactr4或运动干预可显著改善抑郁样行为并减轻氧化损伤，为抑郁症的靶点治疗和非药物干预提供了新思路。

　　

抑郁症是全球范围内致残率最高的精神疾病之一，其临床表现包括持续情绪低落、兴趣减退和认知功能障碍，严重损害患者生活质量并增加自杀风险。尽管其发病机制复杂，涉及神经递质系统紊乱、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴失调、神经炎症、神经营养因子缺乏及肠-脑轴失衡等多维度病理生理过程，但目前临床上仍缺乏有效的治疗策略。近年来，氧化应激作为自由基积累与抗氧化防御系统失衡的病理过程，被证实与抑郁症的发生发展密切相关。临床和 preclinical 研究均发现，抑郁症患者外周血和脑组织中活性氧（ROS）水平显著升高，而慢性应激可诱导前额叶皮层和海马等脑区发生氧化损伤，并伴随促炎因子释放增加。值得注意的是，氧化应激与HPA轴失调、神经炎症等其他病理机制存在复杂交互作用，表明其可能是抑郁症多机制网络中的关键节点。因此，靶向氧化应激很可能成为打破这一病理网络的关键手段。

在非药物干预中，运动疗法因其多靶点调节特性被视为一种有前景的抑郁症治疗策略。Meta分析显示，有氧运动可显著改善抑郁症状，其机制与运动诱导的抗氧化效应密切相关：长期运动可减少脑中ROS积累，缓解脑内氧化应激。尽管运动通过抗氧化调节发挥抗抑郁功效已得到实证验证，但其具体机制尚未完全阐明。

为此，本研究利用慢性束缚应激（CRS）诱导的小鼠抑郁模型，通过高通量测序分析发现抑郁小鼠海马齿状回（DG）区Phactr4表达上调，并进一步探讨了Phactr4-PP1-GSK3β通路在氧化应激中的作用。同时，观察了运动干预对海马Phactr4表达的下调效应及其与GSK3β活化和氧化应激标志物水平的负相关关系。本研究旨在阐明Phactr4在抑郁症氧化应激失衡中的作用，并明确运动通过靶向Phactr4改善氧化应激的潜在机制。

本研究采用的主要技术方法包括：使用慢性束缚应激（CRS）建立小鼠抑郁模型；通过蔗糖偏好测试（SPT）、强迫游泳测试（FST）、高架十字迷宫（EPM）和旷场测试（OFT）进行行为学评估；采用无标记定量蛋白质组学技术分析海马组织差异表达蛋白；利用分子对接和免疫共沉淀（CoIP）验证Phactr4与PP1的相互作用；通过腺相关病毒（AAV）介导的基因敲降技术靶向海马DG区Phactr4表达；使用Western blotting检测蛋白表达及磷酸化水平；通过DHE染色、MitoSOX荧光探针及免疫荧光染色评估氧化应激水平；使用试剂盒检测MDA含量、SOD活性和总抗氧化能力（T-AOC）；在PC12细胞中进行体外验证实验。

3.1. CRS诱导抑郁样小鼠海马DG区出现氧化应激损伤

研究结果显示，经过3周束缚处理后，小鼠表现出快感缺失和行为绝望，同时EPM和OFT测试显示焦虑样行为增加。DHE染色显示海马DG区ROS水平显著升高，4-HNE免疫荧光显示脂质过氧化产物积累，MDA水平上升，而SOD活性和T-AOC同步下降，表明CRS成功诱导了抑郁样行为和氧化应激损伤。

3.2. CRS小鼠海马DG区Phactr4表达上调

蛋白质组学分析显示，抑郁组与对照组海马组织存在大量差异表达蛋白，其中Phactr4表达显著上调。GO富集分析表明差异蛋白与氧化应激通路密切相关，PPI网络分析提示Phactr4与PP1存在直接相互作用。免疫荧光和CoIP实验进一步验证了Phactr4与PP1在海马DG区的共定位和物理结合。

3.3. Phactr4直接与PP1相互作用

通过分子对接和CoIP实验，研究发现Phactr4的C端结构域（640-694）与PP1具有高亲和力，结合能为-5.6 kcal/mol。外源性和内源性CoIP均证实两者可直接结合，且Phactr4过表达可降低p-GSK3β（Ser9）和p-GSK3α（Ser21）水平，而PP1抑制剂Okadaic acid（OA）处理可逆转这一效应。

3.4. 敲降Phactr4改善CRS小鼠抑郁样行为

AAV-sh-Phactr4注射至海马DG区后，抑郁样和焦虑样行为显著改善，同时PP1表达下降，p-GSK3β（Ser9）水平上升，Nrf2和HO-1表达增加，p-p65水平下降，表明Phactr4可能通过PP1-GSK3β通路影响氧化应激和神经炎症。

3.5. Phactr4通过PP1-GSK3β通路调节抑郁样行为和氧化应激

使用MK-2206（GSK3β磷酸化抑制剂）和LiCl（GSK3β去磷酸化抑制剂）进行干预，发现抑制GSK3β活性可逆转Phactr4敲降带来的行为改善和氧化损伤缓解，而激活GSK3β则加剧氧化应激。体外实验进一步证实LiCl处理可减轻CORT诱导的氧化损伤，且该效应被Nrf2抑制剂ML385逆转。

3.6. 上调p-GSK3β改善PC12细胞氧化应激

在CORT处理的PC12细胞中，LiCl预处理可降低MDA积累、提升SOD活性、上调p-GSK3β、Nrf2和HO-1表达，并减少ROS和线粒体损伤，表明GSK3β通过调节Nrf2转录活性参与神经元氧化应激响应。

3.7. 运动通过Phactr4-PP1-GSK3β通路缓解抑郁样行为和氧化应激

21天 treadmill 运动干预显著改善CRS小鼠的抑郁样和焦虑样行为，下调海马DG区Phactr4和PP1表达，提升p-GSK3β（Ser9）、Nrf2和HO-1水平，降低ROS和8-OHdG积累，表明运动可通过抑制Phactr4-PP1-GSK3β通路缓解氧化应激。

本研究系统揭示了Phactr4在慢性应激诱导的抑郁症氧化应激损伤中的关键作用。Phactr4通过直接结合PP1，增强其活性，进而促进GSK3β去磷酸化并激活其 kinase 功能，导致Nrf2核输出和降解增加，抗氧化反应减弱。敲降Phactr4或运动干预可有效阻断这一通路，缓解氧化应激和抑郁样行为。这些发现不仅深化了对抑郁症氧化应激机制的理解，也为临床开发靶向Phactr4的治疗策略和推广运动干预提供了重要理论依据。值得注意的是，GSK3α和GSK3β在氧化应激中的不同作用及运动调控Phactr4表达的上游机制仍需进一步探索。总体而言，本研究突出了Phactr4-PP1-GSK3β通路作为抑郁症治疗潜在靶点的重要性，并为非药物干预提供了新的科学依据。