利用电子顺磁共振（EPR）光谱在实体瘤中原位无创区分线粒体活性氧与全局活性氧生成的新策略

本研究针对肿瘤中亚细胞水平活性氧（ROS）生成位点检测的技术难题，开发了一种基于电子顺磁共振（EPR）光谱的双探针（mitoTEMPO与3CP）检测体系，成功在4T1乳腺癌模型中实现了线粒体ROS与胞内/胞外ROS的原位区分，为肿瘤氧化应激机制研究和靶向治疗策略提供了重要技术支撑。

　　

在肿瘤生物学研究中，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）扮演着双重角色：适度水平的ROS可促进肿瘤发生发展，而过量ROS则导致细胞死亡。更关键的是，ROS的生物学效应高度依赖于其产生的亚细胞位置。线粒体作为细胞内ROS的主要来源，其产生的线粒体ROS（mitochondrial ROS, mtROS）与胞质或其他部位的ROS可能激活截然不同的信号通路，进而影响肿瘤的进展、代谢重编程和转移过程。因此，精确区分不同亚细胞部位的ROS生成，对于理解肿瘤生物学和开发靶向治疗策略具有重大意义。

然而，现有的ROS检测技术存在明显局限性。广泛使用的荧光探针（如DCFH-DA、mitoSOX）缺乏对特定ROS物种的特异性，且易产生自氧化产物干扰结果，需要借助高效液相色谱（HPLC）进行鉴别，操作繁琐。更重要的是，这些光学探针由于组织穿透深度有限，难以应用于活体（in vivo）检测。虽然电子顺磁共振（Electron Paramagnetic Resonance, EPR）光谱技术利用自旋捕捉剂或清除剂具有检测ROS的潜力，但其应用也受限于自旋加合物产率低、稳定性差等问题。

为了解决这些挑战，由Barbara Mathieu、Justin D. Rondeau、Lionel Mignion、Pierre Sonveaux和Bernard Gallez组成的研究团队开展了一项创新性研究，开发了一种基于EPR光谱和双硝基氧探针的无创方法，用于在实体瘤中原位区分线粒体ROS和全局ROS的产生。他们的研究成果发表在《Redox Biology》上，为肿瘤氧化还原状态的精确评估提供了强有力的工具。

本研究主要运用了几项关键技术：1）电子顺磁共振（EPR）光谱学：分别使用9 GHz（X波段）谱仪进行体外细胞实验，以及1 GHz（L波段）谱仪进行小鼠体内肿瘤实验，实时监测硝基氧探针的信号衰减动力学。2）双硝基氧探针系统：采用线粒体靶向的mitoTEMPO和亲水性非靶向的3-羧基普鲁克辛（3-Carbamoyl-PROXYL, 3CP）作为特异性探针，分别感知线粒体和细胞内/外区域的ROS。3）特异性氧化应激诱导模型：使用L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（L-BSO）抑制谷胱甘肽（GSH）合成以诱导胞质氧化应激，使用抗霉素A（Antimycin A）抑制线粒体电子传递链复合体III以诱导线粒体ROS爆发。4）离体验证与定量：通过肿瘤组织取样并使用铁氰化钾（ferricyanide）将羟胺（hydroxylamine）重新氧化回硝基氧，精确量化探针的还原与洗脱贡献。5）遗传学修饰模型：构建过表达线粒体超氧化物歧化酶2（SOD2）的4T1细胞系，用于评估超氧化物（O₂^•-）对信号衰减的具体贡献。所有动物实验均使用BALB/c小鼠皮下接种4T1乳腺癌细胞形成的肿瘤模型。

体外确认双探针ROS检测的位点特异性

研究人员首先在体外验证了方法的可行性。他们利用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶（Xanthine/Xanthine Oxidase）酶促系统产生超氧化物，证实两种硝基氧探针（mitoTEMPO和3CP）的信号衰减均对超氧化物敏感，而加入超氧化物歧化酶（SOD）则可抵消这种衰减。随后，在4T1乳腺癌细胞中，他们使用L-BSO诱导胞质氧化应激和抗霉素A诱导线粒体氧化应激。结果表明，L-BSO处理选择性地加快了3CP的衰减，而对mitoTEMPO无显著影响；相反，低剂量抗霉素A处理选择性地加快了mitoTEMPO的衰减，而不影响3CP。这些结果通过免疫印迹分析过氧化物氧还蛋白（PRX1和PRX3）的氧化状态得到了进一步支持，证实了ROS产生的 compartmentalization（区室化）。

利用双探针无创检测体内肿瘤ROS产生的位点特异性

研究团队将体外验证成功的策略应用于4T1肿瘤荷瘤小鼠模型。他们使用L波段（1 GHz）EPR谱仪无创地监测了肿瘤内探针信号的衰减动力学。与体外结果一致，体内实验显示，L-BSO处理显著增加了3CP的衰减速率，而不影响mitoTEMPO；反之，抗霉素A处理显著增加了mitoTEMPO的衰减速率，而不影响3CP。这一发现证明了该方法具备在活体肿瘤环境中区分不同亚细胞部位ROS产生的强大能力。

血液洗脱对EPR信号衰减无显著贡献

为了排除肿瘤组织灌注和探针洗脱（wash-out）对信号衰减的潜在混淆影响，研究人员进行了离体分析。他们在探针注射后2分钟和10分钟收取肿瘤组织，并通过铁氰化钾处理将羟胺还原产物重新氧化为硝基氧进行定量。结果表明，虽然硝基氧形式的探针浓度发生了预期变化（反映了还原过程），但硝基氧和羟胺的总浓度（硝基氧 + 羟胺）在短时间内保持稳定。这确凿地证明观察到的EPR信号衰减主要源于探针的氧化还原反应，而非通过血流的物理洗脱。

超氧化物对信号衰减的部分贡献

超氧化物是线粒体产生的主要ROS。为了评估其贡献，研究人员构建了稳定过表达SOD2（线粒体超氧化物歧化酶）的4T1细胞系，并将其接种到小鼠体内形成肿瘤。与野生型肿瘤相比，源自SOD2过表达细胞的肿瘤其mitoTEMPO的衰减速率显著降低，而3CP的衰减速率未受影响。这直接证明了线粒体超氧化物的生成是导致mitoTEMPO信号衰减的重要因素之一。同时，衰减未被完全消除也提示其他ROS（如羟基自由基•OH）或活性氮物种（RNS）以及线粒体电子传递链本身的还原能力也可能参与了硝基氧的还原过程。

该研究得出结论：利用EPR光谱学和mitoTEMPO/3CP双探针系统，能够成功地在体外和体内无创地区分实体瘤中线粒体与全局（胞内/胞外）的ROS生产。L-BSO和抗霉素A分别特异性调制胞质和线粒体ROS水平，并选择性地影响相应探针的衰减动力学。离体分析证实信号衰减源于探针的化学还原而非物理洗脱。此外，遗传学证据表明线粒体超氧化物是导致mitoTEMPO衰减的关键因素之一。

这项研究的成功实施具有多重重要意义。首先，它响应了专家共识的呼吁，开发了一种能够进行位点特异性ROS检测的创新工具。其次，该方法克服了现有荧光探针技术的局限性，提供了更高的特异性和无与伦比的活体应用能力。第三，它为肿瘤氧化还原生物学研究提供了强大的技术支撑，使得科学家能够更精确地探究不同亚细胞部位ROS在肿瘤发生、发展、代谢和转移中的具体作用。最后，该技术平台对于筛选和评估靶向特定ROS生成部位（如诱导线粒体ROS以杀死癌细胞，或清除线粒体ROS以抑制转移）的治疗策略具有巨大的转化潜力，有望推动新型抗癌药物的研发。