神经异种移植物通过分子层面的移植物-宿主互作促进脑卒中后长期功能恢复

为解决脑卒中后神经回路再生受限导致的长期功能障碍问题，研究人员开展了人诱导多能干细胞来源神经祖细胞（iPSC-NPCs）移植治疗研究。通过单细胞测序和深度学习行为分析等技术，发现移植细胞分化为GABA能和谷氨酸能神经元，通过NRXN、NRG、NCAM和SLIT信号通路与宿主互作，显著促进血管生成、神经发生和运动功能恢复，为干细胞治疗卒中提供了新机制见解。

　　

脑卒中作为全球致残和致死的主要原因之一，其治疗面临巨大挑战。尽管静脉溶栓和机械取栓等现有治疗手段在一定程度上有助于血管再通，但狭窄的治疗时间窗和潜在并发症限制了其广泛应用，导致约50%的患者遗留长期功能障碍。大脑固有的神经再生能力有限，受损的神经回路难以自行修复，这促使科学家们探索新的治疗策略。干细胞疗法因其多向分化潜能和旁分泌效应，在多种卒中动物模型中展现出促进功能恢复的潜力，包括免疫调节、神经发生、血管生成、血脑屏障修复和神经回路重建等多个方面。然而，尽管间充质干细胞（MSCs）、胚胎干细胞（ESCs）或胎儿来源的神经干细胞/祖细胞（NSCs/NPCs）在临床前研究中取得了鼓舞人心的结果，但在近期的大型卒中患者临床试验中未能证实其疗效。诱导多能干细胞（iPSC）技术的出现为细胞治疗带来了新的希望。iPSC来源的神经祖细胞（NPCs）具有可扩展性、伦理争议小、神经分化潜能强等独特优势，并且符合良好生产规范（GMP）的要求，其安全性也通过基因安全开关系统得到了提升。尽管既往研究表明iPSC-NPCs移植能够释放神经营养因子、在受损神经回路中形成新连接并修复功能缺损，但这些研究仅关注再生的特定方面，基于组织学进行移植物表征，并未解析移植物与宿主之间的分子对话。这种分子层面的互作在很大程度上仍是未知的，并且据我们所知，尚未有研究在单细胞分辨率下进行评估。

为了深入探究iPSC-NPCs移植治疗卒中的潜力及其作用机制，由Rebecca Z. Weber、Beatriz Achon Buil、Ruslan Rust等领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用在无转基因和无异种成分条件下分化的人iPSC-NPCs，在免疫缺陷Rag2^-/-小鼠的脑卒中模型中进行移植实验，并通过活体生物发光成像、单细胞核RNA测序、深度学习辅助的行为学分析以及多种组织学技术，系统评估了移植细胞的存活、分化、迁移及其对宿主脑组织的修复作用。

研究的关键技术方法包括：利用光化学法制备小鼠局灶性脑缺血模型；在卒中后第7天进行人iPSC-NPCs的立体定位脑内移植；通过活体生物发光成像（BLI）纵向监测移植细胞的存活；采用激光多普勒成像（LDI）验证脑血流变化；利用免疫组织化学和共聚焦显微镜进行详细的形态学分析；通过单细胞核RNA测序（snRNA-seq）解析移植细胞和宿主细胞的转录组特征及细胞间通讯；并应用深度学习软件DeepLabCut（DLC）对小鼠的精细运动功能进行自动化、高精度的定量评估。

移植的hiPSC-NPCs在卒中后长期存活并迁移

研究人员在卒中后第7天将表达双报告基因（rFluc-eGFP）的NPCs移植到小鼠损伤脑组织邻近区域。生物发光成像显示，移植细胞在植入后前两周信号稳定，随后至35天时显著增加，表明细胞成功存活并可能发生增殖。通过人细胞核（HuNu）抗体染色证实，移植细胞形成了以细胞密集分布的“移植物中心”和细胞密度较低的“移植物外围”区域，并显示出向邻近皮层区域迁移的趋势。

NPC移植调节小胶质细胞反应，但不影响胶质瘢痕形成或细胞凋亡

卒中后，小胶质细胞被激活，形态由高度分支状变为阿米巴样。与对照组相比，接受NPC移植的小鼠在卒中核心区的离子钙结合适配器分子1（Iba1）免疫反应性显著降低了32%，表明炎症反应减轻。同时，在缺血边界区（IBZ），NPC治疗组的小胶质细胞分支指数和分支化指数均高于对照组，提示其激活状态向更接近静息的状态转变。然而，两组在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性胶质瘢痕的形成以及半胱天冬酶-3（Caspase-3）阳性的凋亡细胞数量上均无显著差异。

增强神经突生长和内源性神经发生

NPC移植促进了脑内的神经再生过程。神经丝重链（NF-H）在缺血边界区的表达以及神经丝轻链（NF-L）在卒中核心区的表达在NPC组均显著高于对照组。利用生物素化葡聚糖胺（BDA）进行顺行性轴突追踪显示，NPC移植小鼠在缺血边界区的轴突连接密度显著增加。此外，移植细胞本身能够伸出人特异性神经细胞粘附分子（hNCAM）阳性的神经突，并投射到同侧胼胝体、对侧半球、扣带皮层以及多个感觉运动皮层区域。更重要的是，NPC移植还显著促进了脑室下区（SVZ）的内源性神经发生，增加了SVZ区域5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和神经元核抗原（NeuN）双阳性细胞的数量。

促进血管生成并改善血管完整性

NPC治疗显著改善了卒中后的血管修复。CD31染色显示，NPC组小鼠缺血皮层的血管面积分数、血管长度和分支数量均显著高于对照组，其水平恢复至与对侧完整皮层相当。EdU标记实验表明，NPC组缺血边界区的新生血管数量更多。虽然两组在伊文思蓝（EB）渗漏实验中没有显示出统计学差异，但通过CD31和纤维蛋白原（Fibrinogen）共染色评估的血管渗漏情况显示，NPC组卒中核心区的相对渗漏显著降低，表明移植有助于血管成熟和完整性恢复。

移植的NPCs主要分化为神经元

组织学分析显示，移植后35天，绝大多数（78%）的HuNu阳性细胞分化为微管相关蛋白2（MAP2）阳性的成熟神经元，10%为GFAP阳性的星形胶质细胞，12%仍表达神经祖细胞标志物Pax6，而未检测到多能性标志物Nanog。仅有少量细胞分化为Olig2阳性的少突胶质细胞前体细胞。增殖动力学研究表明，移植后一周有10%的细胞处于增殖状态（EdU阳性），而至35天时，仅剩2%的细胞仍表达增殖标志物Ki67，表明细胞在初期经历增殖与死亡的动态平衡后，倾向于分化为成熟细胞。

改善卒中后运动功能

通过旋转棒实验、水平梯行走和水平跑道行走等一系列行为学测试评估运动功能恢复。深度学习辅助的DeepLabCut分析能够精确捕捉小鼠步态的细微变化。结果显示，卒中后小鼠运动功能受损，而接受NPC移植的小鼠在移植后五周，其旋转棒测试中的表现和水平梯行走中的错误率（特别是对侧前肢和后肢）均显示出显著优于对照组的恢复。精细运动分析揭示，NPC治疗完全恢复了对侧腕部、前趾尖等身体部位在行走中的平均高度，而对照组仅部分恢复。值得注意的是，对趾长伸肌（EDL）和比目鱼肌（SOL）的神经肌肉接头（NMJ） innervation状态和面积在两组间无差异，提示功能恢复可能源于中枢神经系统的重塑而非外周肌肉神经支配的改变。

单细胞分子图谱揭示移植物细胞身份

对移植后小鼠脑组织进行单细胞核RNA测序（snRNA-seq），成功捕获了1149个人类移植物来源的细胞核。分析发现，移植的NPCs主要分化为成熟的神经元和胶质细胞，其中GABA能神经元（44%）和谷氨酸能神经元（42%）占主导，另有6%的星形胶质细胞和7%的干/祖细胞。对GABA能神经元的进一步亚型分析显示，其具有小清蛋白（PVALB）、生长抑素（SST）、血管活性肠肽（VIP）和溶酶体相关膜蛋白5（LAMP5）抑制性中间神经元的特征。免疫组化结果也证实了移植细胞中PVALB、SST和VIP的表达。

解析移植物-宿主间的分子对话

研究人员利用CellChat软件深入分析了移植物与宿主细胞之间的配体-受体互作。发现GABA能移植物细胞（hGABA）在所有移植物细胞中拥有最多 predicted 的传入和传出相互作用。这些互作主要通过神经轴突蛋白（NRXN）、神经调节蛋白（NRG）、神经细胞粘附分子（NCAM）和SLIT等信号通路进行，这些通路与神经元再生、突触可塑性、树突arborization和轴突导向密切相关。hGABA细胞作为“影响者”（influencer）在NRXN信号中发挥作用，而在NRG、NCAM和SLIT信号中则主要作为“发送者”（sender）。具体的配体-受体对包括NRXN1-LRRTM4（与mGlut和mGABA细胞）、NRG3-ERBB4（与mOlig和mGABA细胞）、NCAM1-NCAM1（与多数宿主细胞）以及SLIT2-ROBO2（与mGlut和mGABA细胞）。作为概念验证，Boyden chamber实验表明，NPCs在体外能够响应小鼠Slit2蛋白的浓度梯度而发生迁移，支持了SLIT信号在引导移植物细胞迁移中的作用。

该研究系统性地证实了人iPSC来源的神经祖细胞移植治疗卒中的巨大潜力。移植细胞不仅能够长期存活、迁移并整合到宿主脑组织中，还通过分化为特定类型的神经元，特别是补充了卒中后大量丢失的GABA能中间神经元，从而与宿主组织建立广泛的分子对话。这种对话通过NRXN、NRG、NCAM和SLIT等关键信号通路， orchestrates 了一个促进血管生成、神经发生、轴突再生和炎症减轻的修复性微环境，最终驱动了结构和功能的显著恢复。研究首次在单细胞分辨率上揭示了神经移植物与卒中宿主脑组织之间的分子互作机制，为理解干细胞治疗的作用原理提供了深刻见解。所采用的细胞制备方案符合临床转化要求，结合深度学习行为学评估等先进技术，为未来开展临床试验奠定了坚实的理论和实践基础。这项研究成果不仅对卒中治疗具有重要指导意义，其揭示的机制也可能适用于其他涉及神经元丢失的急性神经系统损伤。