产前对羟基苯甲酸丙酯暴露诱导跨代遗传的卵巢储备功能减退及其表观遗传机制与干预策略研究

本研究针对环境内分泌干扰物对女性生殖健康的跨代影响难题，揭示了产前对羟基苯甲酸丙酯(PrP)暴露可通过诱导Rhobtb1基因持续低甲基化，经卵细胞表观遗传传递导致F1-F3代子代卵巢储备功能减退(DOR)的分子机制。研究人员发现Rhobtb1通过泛素化途径调控FGF18表达，激活MAPK信号通路引发颗粒细胞凋亡，并在DOR患者血液中验证类似表观特征，最终证实甲基供体饮食干预可有效改善跨代遗传的DOR表型，为DOR的防治提供了新思路。

　　

随着全球生育年龄的推迟和环境污染加剧，卵巢储备功能减退(Diminished Ovarian Reserve, DOR)的发病率逐年攀升，约26%接受辅助生殖技术治疗的女性患者存在DOR问题。DOR不仅导致生育能力下降，还与早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency, POI)、过早绝经以及多种长期健康问题密切相关。然而，DOR的病因复杂多元，涉及遗传和非遗传因素，其中环境因素对女性生殖健康的影响近年来引起全球关注。

环境内分泌干扰物(Endocrine-Disrupting Chemicals, EDCs)是一类外源性物质，能够干扰激素功能，与癌症、生殖障碍、认知障碍和肥胖等多种疾病相关。对羟基苯甲酸酯类(Parabens, PBs)作为典型的EDCs，近一个世纪以来被广泛用作化妆品、食品和药品工业的防腐剂。研究表明，人体多种生物样本（包括尿液、血液、脂肪组织、乳汁和胎盘）中均可检测到对羟基苯甲酸甲酯(MeP)、乙酯(EtP)、丙酯(PrP)和丁酯(BuP)四种形式。既往研究证实，对羟基苯甲酸酯类暴露会损害啮齿动物和人类的生殖功能。

值得注意的是，在胚胎发育的关键阶段暴露于有害物质会显著增加后代在晚年患病的脆弱性。然而，这种损害是否能够跨代持续及其潜在机制尚不明确。跨代表观遗传遗传(Transgenerational Epigenetic Inheritance, TEI)允许表观遗传信息（包括改变的表观遗传状态和相关疾病特征）通过生殖系跨代传递，而无需后代直接暴露于有害环境因素。研究表明，DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA都参与了TEI过程。

先前的研究发现，产前PrP暴露会导致F1代小鼠出现DOR，但对多代卵巢储备功能的影响尚未探索。为此，研究人员开展了系统研究，揭示了PrP暴露诱导DOR跨代遗传的表观遗传机制，并提出了潜在的干预策略。该研究成果发表于《Nature Communications》杂志。

本研究采用了多种关键技术方法：通过动物模型进行产前PrP暴露实验并观察F1-F3代表型；使用全基因组甲基化测序(WGBS)和单细胞全基因组甲基化测序(scWGBS)分析表观遗传变化；采用RNA测序(RNA-seq)技术分析转录组差异；通过体外细胞实验验证Rhobtb1功能机制；利用人群队列（包括60名POI患者、63名DOR患者和60名对照）验证临床相关性。

Transgenerational inheritance of DOR phenotypes was observed after prenatal PrP exposure

研究人员通过腹腔注射给予孕鼠人类相关剂量(7.5 mg/(kg·d))的PrP，覆盖胎儿性别决定期(E7.5-E13.5)。结果显示，产前PrP暴露对孕鼠体重、每窝产仔数和子代性别比无显著影响，但导致F1-F3代雄性出生体重和F3代雌性出生体重显著降低。在12周龄时，PrP暴露组F1-F3代雌性子代的抗穆勒氏管激素(AMH)水平显著降低，闭锁卵泡数量显著增加，原始卵泡数量显著减少。此外，PrP暴露还导致F1-F3代子代不规则动情周期比例升高，F3代表现出延长的动情后期和间情期。虽然E2水平呈下降趋势，但孕酮(P4)水平在三代中均无显著差异。这些发现表明，产前PrP暴露诱导的DOR表型可以跨代遗传。

Apoptosis of granulosa cells and deteriorated oocyte quality were seen in multiple generations

颗粒细胞(GCs)凋亡是卵泡闭锁和卵巢储备功能不良的主要原因。TUNEL染色结果显示，在所有F1-F3代中，PrP暴露组的GC凋亡均显著升高。电镜观察发现，PrP暴露组F1-F3代子代小鼠GC中线粒体异常显著增加，主要表现为肿胀形态和嵴断裂，F3代PrP暴露组中GC与卵母细胞之间的突触也变得模糊。通过排卵诱导评估卵母细胞质量发现，PrP暴露组F1和F3代MII期卵母细胞数量急剧减少，BMP15蛋白表达水平也显著降低，表明卵母细胞质量下降。

Hypermethylated Rhobtb1 might mediate the transgenerational inheritance of DOR

通过多组学测序分析，研究人员发现PrP暴露的F3代子代卵巢中有1505个显著高甲基化区域和1283个低甲基化区域，分别对应963个高甲基化基因和766个低甲基化基因。值得注意的是，与Rho相关BTB结构域包含蛋白1(Rhobtb1)和4930519F24Rik基因相关的差异甲基化区域在F2卵巢、F2卵母细胞和F3卵巢中表现出一致的低甲基化模式。Rhobtb1启动子区域的甲基化水平在PrP暴露组的F2和F3代卵巢组织以及F2卵母细胞中均显著降低。RNA测序显示，暴露组Rhobtb1表达水平有升高趋势，Western blot和免疫组化证实RhoBTB1蛋白在F2和F3代卵巢以及F2卵母细胞中显著增加。这些结果表明，Rhobtb1启动子区域的低甲基化可能介导了产前PrP暴露诱导的DOR的TEI。

The hypomethylation and overexpression of Rhobtb1 led to DOR by inducing GC apoptosis

体外实验发现，PrP暴露导致KGN细胞中Rhobtb1启动子区域CpG位点甲基化水平显著降低，RhoBTB1蛋白水平显著增加，AMH和E2浓度显著降低，并观察到剂量依赖性的凋亡增加。线粒体凋亡通路关键基因的蛋白水平也发生显著变化：BCL-2明显降低，BAX和cleaved Caspase-3(active-Caspase3)显著增加。通过腺病毒载体过表达RhoBTB1后，同样观察到AMH和E2水平显著降低，凋亡GCs数量增加，线粒体凋亡通路相关基因发生显著改变。这些发现表明，Rhobtb1低甲基化可能导致GCs过度凋亡。

Potential targets for RhoBTB1 identified through ovarian transcriptomic profiles and DNA methylation patterns

为了探索低甲基化Rhobtb1诱导DOR的TEI机制，研究人员对F3代卵巢组织进行了RNA测序和WGBS。发现了544个差异表达基因(DEGs)，其中288个下调，256个上调。KEGG分析显示，氧化磷酸化、p53信号通路和类固醇生物合成等相关通路显著富集。通过整合基因表达和DNA甲基化水平，发现了5个共同基因：Claudin 18(Cldn18)、组织蛋白酶K(Ctsk)、缝隙连接蛋白γ3(Gjc3)、成纤维细胞生长因子18(Fgf18)和RhoBTB1(Rhobtb1)。值得注意的是，Fgf18的甲基化变化区域位于远端基因间区域。

RhoBTB1 activated the MAPK pathway and induced GC apoptosis by upregulating FGF18 via a ubiquitination-dependent pathway

RhoBTB1是Rho-GTP酶家族的非典型成员，其BTB结构域通过同源或异源寡聚化促进蛋白质复合物组装。经典机制研究表明，BTB1结构域特异性招募基于Cullin 3的E3泛素连接酶复合物，而底物识别由BTB2结构域、GTP酶结构域和C末端区域协同介导，从而实现底物泛素化和随后的降解。通过STRING数据库分析发现，RhoBTB1与FGF18和CTSK之间存在间接相互作用。PrP暴露后，KGN细胞中FGF18蛋白增加，MAPK信号通路激活；在Rhobtb1过表达模型中也观察到同样现象。沉默Fgf18后，MAPK信号通路的激活显著减少，而RhoBTB1表达不变；沉默Rhobtb1后，FGF18表达和MAPK通路激活均显著降低。这些结果表明，RhoBTB1可能是FGF18的上游调节因子。通过使用MLN4924（一种抑制Cullin3复合物激活的neddylation抑制剂）和MGI32（一种蛋白酶体抑制剂）处理细胞，发现两种处理均导致FGF18表达水平显著降低，表明RhoBTB1通过泛素化途径增强FGF18表达，不是直接调节FGF18，而是通过选择性消除FGF18抑制剂的"去抑制"机制。

Hypomethylated Rhobtb1 in blood samples may indicate DOR/POI in women

为了验证小鼠研究结果与人类DOR的相关性，研究人员分析了DOR和POI患者血液样本中Rhobtb1启动子区域的甲基化状态。发现DOR和POI患者Rhobtb1启动子区域多个CpG位点的甲基化水平显著降低，这些变化均位于启动子区域。这些结果表明，血液样本中共享的表观遗传特征可能作为DOR女性的潜在生物标志物。

Epigenetic therapy ameliorated DOR induced by prenatal PrP exposure in F1-F3 offspring mice

考虑到PrP暴露子代卵巢组织中存在低甲基化的Rhobtb1，研究人员考察了甲基供体(MD)饮食的治疗潜力。在怀孕和哺乳期间给F0小鼠喂食MD饮食后，PrP暴露的F1-F3代子代的不规则动情周期比例降低，AMH水平显著改善，三代原始卵泡数量增加，F1和F3代子代的闭锁卵泡数量显著减少。与暴露组相比，MD治疗后GCs凋亡显著减少，卵巢中RhoBTB1的表达水平也在PrP+MD组的F1-F3代子代中得到挽救。因此，MD可以作为一种基于表观遗传的治疗方法，改善产前PrP暴露诱导的DOR的跨代遗传。

本研究证实DOR可由祖先暴露于有害因素而跨代遗传，为了解女性生育力下降的病因提供了新见解，并强调了针对DOR的潜在表观遗传治疗干预措施。研究发现产前PrP暴露诱导的Rhobtb1启动子低甲基化这种异常表观遗传印记能够逃避DNA甲基化重编程，通过卵母细胞传递到F3代，导致后代卵巢中RhoBTB1蛋白积累。升高的RhoBTB1水平通过泛素-蛋白酶体系统导致FGF18过表达，随后激活MAPK信号通路，引发线粒体依赖性颗粒细胞凋亡，最终使多代易患DOR。

值得注意的是，在DOR和POI女性血液样本中观察到了类似的Rhobtb1低甲基化模式，表明这些表观遗传变化可能作为卵巢衰老的诊断标志物。虽然美国FDA已批准几种DNA甲基化抑制剂治疗多种疾病，但针对低甲基化的药物方法尚未获得批准。甲基供体饮食支持一碳代谢平衡，已被证明可缓解PCOS症状、代谢紊乱和啮齿动物的病理血管变化。人群研究进一步支持了叶酸摄入与改善胚胎质量和降低不孕风险的关联。一碳代谢饮食据报道可提高AMH水平和自然受孕率，为对抗不孕提供了新的治疗策略。

尽管儿童产品中对羟基苯甲酸酯类的使用受到严格监管，但其在各个领域的广泛应用仍然持续。鉴于对羟基苯甲酸酯类暴露与生殖功能障碍、乳腺癌、肥胖、甲状腺疾病和过敏性皮炎等健康问题的关联，实施更严格的控制措施保护孕期女性的跨代健康至关重要。具体措施应优先提高孕期女性对PBs风险的认识，促进主动避免PBs暴露，鼓励使用有机认证和无对羟基苯甲酸酯类的护肤产品和食品。

总之，本研究结果表明DOR在祖先暴露于有害因素后可以跨代遗传，为了解女性生育力下降的病因提供了新见解，并强调了针对DOR的潜在表观遗传治疗干预措施。未来研究应涵盖更广泛的领域，包括组蛋白修饰和非编码RNA，以更全面地理解这种跨代现象。此外，腹腔注射可以在小鼠中实现精确给药且应激最小，但与人类对羟基苯甲酸酯类暴露途径（如皮肤吸收、摄入或吸入）不同，因此限制了直接应用于人类。未来研究采用现实暴露途径并将此研究扩展到更接近人类生殖生物学的灵长类模型，将有助于将这些发现转化为临床应用。