循环细胞外囊泡isomiR特征预测多发性骨髓瘤患者对达雷妥尤单抗的治疗反应

为解决多发性骨髓瘤(MM)患者对达雷妥尤单抗(DARA)治疗反应预测难题，研究人员开展血浆细胞外囊泡(pEV) isomiR测序研究，利用机器学习构建生物驱动的EV isomiR-基因靶点网络，开发出预测模型(AUC=0.98)，可准确预测持久反应(≥6个月)、无进展生存(HR:33.09)和总生存(HR:3.81)，为MM治疗提供无创替代骨髓活检的新策略。

　　

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma, MM)是一种由骨髓中克隆性浆细胞不受控增殖引起的血液恶性肿瘤，其特征表现为高度的患者间和患者内克隆异质性，导致对治疗的反应存在巨大差异。近年来，随着免疫调节药物(如来那度胺)、蛋白酶体抑制剂(如硼替佐米)以及单克隆抗体(如达雷妥尤单抗，daratumumab, DARA)的应用，MM患者的生存期得到了显著改善。然而，尽管一线治疗通常能获得良好反应，大多数患者最终还是会复发。复发/难治性多发性骨髓瘤(Relapsed/Refractory Multiple Myeloma, RRMM)患者对后续治疗方案的个体反应差异仍然很大，部分患者可能出现原发耐药或早期复发。因此，MM从一种不治之症转变为慢性病，很大程度上取决于能否改进生物标志物策略，以准确监测治疗反应，并理想地预测个体患者的有利结局。

目前，评估治疗反应的黄金标准包括监测血液和/或尿液中的M蛋白和游离轻链水平，以及进行骨髓(Bone Marrow, BM)检查以确认完全缓解或检测微小残留病(Minimal Residual Disease, MRD)。在骨髓中达到MRD阴性状态与更优的无进展生存期(Progression-Free Survival, PFS)和总生存期(Overall Survival, OS)相关。然而，使用新一代流式细胞术或新一代测序(Next-Generation Sequencing, NGS)进行骨髓MRD评估具有侵入性，且给患者带来负担，限制了其连续使用，并且可能由于多灶性疾病、髓外疾病的存在和/或骨髓抽吸物/活检质量差而产生假阴性结果。值得注意的是，与单时间点MRD阴性结果相比，通过NGS持续测量的MRD阴性显示出更优的预后价值。因此，迫切需要易于解读、微创的生物标志物，以更好地预测哪些个体患者正在反应或可能对治疗产生反应。

除了驱动突变，非编码RNA，特别是microRNA(miRNA)，在恶性浆细胞的转化和耐药性中扮演重要角色。miRNA是液体活检方法中很有前景的癌症生物标志物靶点，因为它们由存活和死亡的恶性细胞及基质细胞释放。这些细胞游离miRNA的动态混合物被细胞外囊泡(Extracellular Vesicles, EVs)稳定并保护，可以从由代谢活跃细胞分泌的EVs中提取。将循环miRNA作为癌症生物标志物通常涉及对肿瘤组织活检或血浆进行测序，然后通过定量逆转录PCR(Quantitative Reverse-Transcription PCR, RT-qPCR)进行检测。由于单个miRNA通常缺乏组织和细胞特异性，因此采用分析方法来构建多miRNA特征，以提高疾病检测和治疗反应预测的准确性。

测量与血浆EVs(plasma EVs, pEVs)结合的miRNA有助于减少生物噪音，并已在新诊断的MM患者中显示出预后价值。miRNA分析通常使用标准测序协议进行，但这些协议在文库制备过程中容易产生连接和扩增偏差。遗憾的是，标准测序和RT-qPCR缺乏单核苷酸分辨率，无法准确识别和量化功能性miRNA变体(isomiRs)及其基因靶点。

在这项发表于《Cell Reports Medicine》的研究中，Cristina Gomez-Martín、Esther E.E. Drees、D. Michiel Pegtel及其同事使用内部开发的、针对低输入液体活检样本优化的小RNA测序协议“IsoSeek”，以单核苷酸分辨率分析了pEV结合的isomiRs(pEV-isomiRs)。结合严格的标准化和校正程序，他们生成并验证了pEV-isomiR特征，利用机器学习来检测活动性MM、监测治疗反应并预测持久反应。该方法仅需1毫升血浆，可扩展至标准诊断性MiSeq Illumina平台，并且在分析前条件上具有一定灵活性，从而简化了临床实践中的实施。

为了开展这项研究，研究人员收集了MM患者和健康对照者的血浆样本，使用自动化的尺寸排阻色谱(Size-Exclusion Chromatography, SEC)标准化分离EV，并采用优化的EV-RNA提取协议和EV-miRNA测序(IsoSeek方法)以确保可靠的miRNA检测并最小化技术变异。队列包括来自临床试验(如NIVO-DARA和DARA-ATRA试验)和生物库(如Biolymph VUmc/AMC)的RRMM和NDMM患者样本，以及年龄/性别匹配的健康对照。关键实验技术主要包括：血浆EV分离与表征（SEC、Western Blot、TEM、tunable resistive pulse sensing）、小RNA测序与isomiR分析（IsoSeek方法，与标准NEBNext协议对比）、机器学习建模（交叉验证LASSO回归）、靶点组分析（miRTargetLink）、生存分析（Kaplan-Meier、Cox回归）以及细胞来源反卷积分析（CIBERSORTx）。样本队列来源包括阿姆斯特丹UMC的临床试验患者和生物库储存样本。

免疫细胞来源的小EV存在于MM患者的循环中

研究人员首先建立了一个标准化的工作流程，从MM患者和健康对照的血浆中分离pEVs。通过SEC分离EVs，并使用tunable resistive pulse sensing测量颗粒浓度，发现活动性疾病患者、治疗反应患者和健康捐赠者的平均颗粒浓度存在差异。Western Blot检测到EV标志物（CD63、CD81、flotillin 1、syntenin），而内质网相关蛋白calnexin未在EV富集部分中检测到。电镜显示 predominantly 小EVs和少量较大EVs的混合群体。对EV RNA进行转录组测序和CIBERSORT反卷积分析（使用LM22单细胞参考数据集）显示，bulk EV群体中含有多种潜在的免疫细胞来源RNA，但活动性疾病和反应状态之间的定量差异无法通过此方法确定。研究表明，MM患者循环EVs的水平本身似乎与反应状态无关。

IsoSeek检测MM患者血浆EV中的数千种isomiRs

研究人员使用IsoSeek小RNA测序方法对pEV isomiRs进行分析，并将其性能与标准NEBNext协议进行比较。IsoSeek在pEV isomiR检测方面表现出更高的准确性，其miRNA类别映射读长的比例相对于其他RNA物种更高。IsoSeek的单核苷酸分辨率允许进行准确的isomiR分析，将每个血浆EV样本中的特征数量从约400个miRNA（经典miRNA注释）增加到15,000个isomiRs，其中约1,000个isomiRs的每百万读长计数超过10。结果强调了IsoSeek在获取血浆EV miRNA/isomiR谱用于生物标志物目的方面的增强准确性。

pEV-miRNA分类器特征区分活动性MM患者与年龄/性别匹配的健康个体

研究人员对总共84个样本（34名活动性疾病MM患者和44名健康对照）进行了IsoSeek miRNA分析。主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)显示，活动性疾病样本和健康捐赠者样本没有清晰的聚类。为了开发一个 robust 的基于miRNA的分类器来区分活动性MM患者和健康对照，他们将样本随机分为训练集和验证集，并应用交叉验证的LASSO回归来最小化特征选择偏差并避免过拟合。他们评估了两种不同的miRNA注释作为特征输入：1) “经典miRNA注释”，即给定miRNA的所有读长（包括其衍生序列）被聚合，无论这些衍生物的已知生物学意义如何；2) 功能性的“isomiR注释”，即经过功能验证的经典miRNA和非模板添加(Non-Templated Additions, NTA) NTA-A和NTA-U被视为独立特征。

使用经典miRNA注释，他们确定了一个包含22个miRNA的最佳模型，在训练集中具有最低的错误分类错误（AUC = 1.0）。该模型在独立验证集中实现了高度区分性能，AUC为0.98（95% CI: 0.94-1.00），仅误判了3个样本。使用isomiR作为输入特征，选择了一个包含39个isomiRs的较大模型（基于最小分类错误优化，训练集AUC=1.0），在验证集中也实现了高度区分的AUC为0.95（95% CI: 0.86-1.00），但比经典miRNA注释多误判了两个样本。

为了进一步评估ML生成的分类模型的稳健性，他们分析了由Manier等人使用NEBNext协议生成的基线样本的外部pEV-miRNA测序数据（10名新诊断多发性骨髓瘤(NDMM)患者和5名健康对照）。尽管存在显著的分析前和分析差异，他们的22个经典miRNA分类器准确地区分了健康个体和活动性疾病患者（AUC为0.98，95% CI: 0.93-1.00），仅误判了15个患者样本中的2个。相比之下，isomiR模型在该外部患者队列中验证失败（AUC: 0.52; 95% CI: 0.16-0.87）。当将miRNA和isomiR模型应用于疾病对照队列（10名代谢活跃(FDG-PET阳性)霍奇金淋巴瘤(HL)患者和年龄/性别匹配的健康对照(n=9)）时，在相同的分析前和分析条件下，几乎所有样本都被误分类，表明EV-isomiR分类器对MM具有疾病特异性。

为了探索训练用于检测活动性MM的模型的潜在生物学相关性，他们对分类器特征进行了靶点组分析。诊断模型中EV-miRNA最靶向的mRNA包括MYC和BCL2，这些是MM中已确立的可成药靶点。因此，来自活动性疾病MM患者的bulk pEVs可能包含一种“肿瘤衍生信号”，该信号至少部分来源于克隆性扩增的浆细胞。为了验证这一假设，他们对5名活动性疾病患者和5名健康对照的pEVs进行了EV-mRNA测序。基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)显示，活动性MM样本中浆细胞和B细胞本体论显著富集。差异表达(Differential Expression, DE)分析进一步支持了这一无偏方法，该分析发现几个浆细胞特异性转录本在活动性疾病患者分离的总pEV池中富集。

这些发现表明，来自活动性疾病MM患者的pEVs含有来源于恶性浆细胞和BM中肿瘤相关基质的miRNAs、isomiRs和mRNAs，这些可用于MM患者的液体活检。

EV-isomiRs作为监测MM患者疾病活动性的生物标志物

目前，MM诊断依赖于侵入性骨髓活检，而治疗反应通过生物体液中的M蛋白或游离轻链水平进行监测。尽管敏感，但这些标志物对肿瘤进化的洞察有限，并且缺乏实质性的预后价值。为了研究pEV-miRNAs是否可以作为动态监测工具，研究人员将IsoSeek应用于来自24名RRMM患者的70个血浆样本，这些患者参加了两项不同的采用含达雷妥尤单抗联合治疗的临床试验。

他们将70个样本（35个来自活动性疾病患者，35个来自在采集时根据IMWG标准达到PR或更好的患者）随机分为训练集(n=42)和验证集(n=28)。对整个集合的PCA分析显示，反应患者和活动性疾病患者的样本没有清晰分离，基于含达雷妥尤单抗治疗方案类型的分离也不明显。使用交叉验证的LASSO回归模型策略，他们开发了两个模型：一个使用经典miRNA注释，另一个使用isomiR分类。

经典miRNA模型仅包含3个miRNA，在RRMM患者的独立验证样本中取得了非常有前景的反应评估性能，AUC达到0.92（95% CI: 0.80-1.00）。isomiR模型包含12个isomiRs（6个经典miRNA，3个NTA-U和3个NTA-A isomiRs），在验证集中实现了略高的AUC为0.93（95% CI: 0.81-1.000），误判了两个样本为“反应”，而M蛋白动态表明是活动性疾病。

为了研究isomiR模型在评估达雷妥尤单抗基础方案之外的试验反应方面的特异性，他们前瞻性地收集了13名RRMM患者和4名NDMM患者接受标准治疗(Standard Of Care, SOC)方案或不同临床试验治疗的样本。尽管治疗存在差异，大多数样本被正确分类，并且isomiR模型的表现优于经典miRNA模型（经典模型AUC: 0.77; 95% CI: 0.52-1.00），在这个独立验证集中AUC为0.98（95% CI: 0.94-1.00）。尽管有两个“反应”样本被误判，但所有在临床试验之外接受含达雷妥尤单抗方案的5名患者都被正确分类。

为了获得更多关于isomiR分类器的生物学见解，他们对模型中的所有isomiRs进行了靶点组分析，确定了TLR4和CDK6作为可能具有临床相关性的靶点。此外，他们希望评估实施他们基于测序的方法是否可转化为临床实践中更常用的诊断方法。他们使用MiSeq Illumina测序平台重新测序了10个样本（5个来自活动性疾病患者，5个来自治疗反应[PR或更好]患者）。经典模型和isomiR模型都正确分类了大多数样本，少数误分类与在Novaseq平台上阈值附近的样本一致。

最后，他们试图在9名接受含达雷妥尤单抗治疗的RRMM患者的连续样本中验证反应模型的稳健性，将pEV-isomiR模型（来自图3C）预测的反应状态与评估反应的黄金标准M蛋白指标进行比较。pEV-isomiR反应模型紧密跟踪了治疗期间基于M蛋白的反应动态，仅存在少数误分类。然而有趣的是，pEV-isomiR模型将两名患者误判为具有“反应”（由箭头指示），而M蛋白水平表明是“活动性疾病”。但纵向随访显示，这两名患者最终在几个月后达到了部分或更好的反应，这表明在某些情况下，pEV isomiRs可能不仅能够监测而且能够预测反应。

总的来说，这些发现突显了pEVs作为生物学相关、微创的isomiRs来源，具有作为RRMM患者反应评估工具的潜力。

血浆EV-isomiRs是多发性骨髓瘤生存的预后生物标志物

为了探索pEV-isomiRs在预测个体患者持久反应方面的预后潜力，研究人员分析了34名活动性疾病MM患者的治疗前样本，这些患者即将接受含达雷妥尤单抗的方案。他们遵循了基于先前研究的六个月阈值，旨在预测MM患者的持久反应。对于训练集，他们包括了19名RRMM患者的样本，这些患者至少失败了两线先前的治疗。在这些患者中，8名对达雷妥尤单抗实现了持久反应（PR或更好超过六个月），而11名是难治性或经历了早期复发。验证集包括10名RRMM患者接受含达雷妥尤单抗方案前的样本和5名NDMM患者（其中4名接受SOC（VRD或VTd诱导/Vtd后接自体干细胞移植和来那度胺维持））。在验证集的15名患者中，7名表现出对治疗的不良反应（即治疗6个月内PD，全部为RRMM患者），8名具有持久反应（3名RRMM和5名NDMM患者）。

一个isomiR模型（包含12个isomiRs）在验证集中取得了有前景的AUC为0.84（95% CI: 0.63-1.00），仅误判了三名患者：两名接受SOC的NDMM患者和仅一名接受达雷妥尤单抗的RRMM患者。这产生了75%的阳性预测值(Positive Predictive Value, PPV)和86%的阴性预测值(Negative Predictive Value, NPV)。经典miRNA模型未能取得良好的性能，突显了isomiR分析的重要性。

有趣的是，isomiR-基因-靶点网络包括了BCL2和MYC，这与图2D中的MM模型网络有重叠。对包括训练和验证集中所有RRMM患者(n=29)的PFS进行Kaplan-Meier分析，风险比(Hazard Ratio, HR)为33.1（95% CI: 4.2-262, p < 0.005）。尽管患者数量和随访期有限，反应持久性分类器特征也对OS有预测性，HR为3.8（95% CI: 1.05-13.99, p < 0.05）。包括NDMM在内的全队列PFS的Kaplan-Meier分析HR为9.04，OS的HR为3.61。

在模型中的miRNAs中，经典的mir-148a-3p展示了一组生物学相关的靶点，包括已经提到的BCL2和MYC。为了探索其组织特异性，他们评估了其在IsomiRDB中所有注释组织和细胞分选样本(n=1692)以及miSRA分析器中所有“浆细胞”样本中的丰度。结果表明，与其它细胞类型和组织相比，miR-148a-3p表达对浆细胞高度特异。

将基线M蛋白水平与基于isomiR的预测模型进行比较，突显了模型的优越预测价值，PFS和OS的Kaplan-Meier分析进一步支持了这一点。

这些发现表明，如果在更大队列和更长随访期中得到验证，EV-isomiR检测可以支持临床医生选择最可能从特定（含达雷妥尤单抗）治疗中受益的RRMM患者，同时可能使其他患者免于无效的干预。

讨论与结论

本研究证明了利用机器学习策略分析血浆细胞外囊泡(pEV)小RNA测序数据，可以生成具有生物学动机的isomiR特征，用于预测多发性骨髓瘤患者对达雷妥尤单抗治疗的反应。研究人员开发并验证的pEV-isomiR分类器能够准确区分活动性疾病与健康对照，监测治疗反应，并预测持久反应和生存结局。其预测性能优异，AUC值高达0.98，风险比显著（PFS的HR: 33.09, OS的HR: 3.81）。

该研究的重要意义在于提供了一种微创、可扩展的液体活检方法，仅需1毫升血浆，有望成为侵入性骨髓活检的替代或补充方案。通过IsoSeek高分辨率测序和机器学习建模，研究人员不仅实现了高精度的预测，还通过靶点组分析将 prognostic classifier 与已确立的MM药物靶点BCL2和MYC联系起来，揭示了其生物学相关性。这表明循环EVs中的isomiR特征能够反映骨髓肿瘤微环境和恶性浆细胞的生物学状态。

尽管本研究存在队列规模相对较小、随访时间有限的局限性，但其结果表明pEV-isomiR特征在MM的精准医疗中具有巨大潜力。未来在更大规模、多中心队列中的外部验证将进一步提高其临床实用性。如果得到证实，这种基于血液的检测可以帮助临床医生为RRMM患者选择最有效的治疗方案（如达雷妥尤单抗或转向如双特异性抗体、CAR-T细胞疗法等新型T细胞免疫疗法），从而实现真正的个体化治疗，改善患者预后，并可能减少无效治疗带来的毒性和成本。