蛋白酶样连接酶CtaG介导的远端肽链延伸机制解析：为核糖体非依赖型酰胺键合成提供新范式

本研究针对非核糖体肽合成酶（NRPS）传统近端延伸机制的局限性，通过生物化学、结构生物学和突变分析手段，揭示了蛋白酶样连接酶CtaG通过乒乓机制催化两个不同肽基载体蛋白（PCP）底物间酰胺键形成的独特机理。该发现拓展了酶催化酰胺键形成的工具箱，为工程化合成非核糖体肽提供了新策略。

　　

在微生物天然产物合成领域，非核糖体肽（NRP）因其结构多样性和显著的生物活性而备受关注。传统观点认为，这类化合物主要由模块化的非核糖体肽合成酶（NRPS）组装而成，其通过腺苷化（A）结构域激活氨基酸，再通过缩合（C）结构域催化肽基载体蛋白（PCP）所携带构建单元间的肽键形成，整个过程遵循严格的“分子装配线”逻辑和近端延伸机制。然而，这种经典机制存在酶系庞大、结构刚性且难以重编程等局限性，极大地限制了其在合成生物学中的应用。因此，探索非模块化、更灵活的肽组装策略成为领域内的重要挑战。

在此背景下，由Clostridium cellulolyticum产生的独特多硫酰胺抗生素——Closthioamide（CTA）的生物合成途径引起了研究人员的高度兴趣。与经典NRPS途径不同，CTA的组装涉及一系列非典型的独立酶。其中，一个关键的科学问题是：负责将对羟基苯甲酸（PHBA）与三-β-丙氨酸（(βAla)₃）单元连接起来的酰胺键是如何形成的？为了回答这一问题，由Finn Gude和Annkathrin Bohne等人领导的研究团队对推测为木瓜蛋白酶样连接酶的CtaG进行了深入探究。他们的研究成果发表在《Chem》期刊上，系统地阐明了CtaG以一种前所未有的“乒乓”机制催化远端肽链延伸的过程，这不仅是对酶学催化机制的深刻揭示，也为设计和工程化新型核糖体非依赖型肽组装线路提供了宝贵的蓝图。

为开展本研究，研究人员综合运用了多种关键的生物化学与结构生物学技术。主要包括：利用体外重构实验验证CtaG的底物特异性，证明其严格依赖PCP结合的底物；通过化学探针（如氯丙烯酰胺）进行共价交联实验，研究CtaG与不同PCP（CtaH和CtaE）的相互作用顺序和方向性；应用蛋白质结晶学和单波长反常散射（SAD）技术，解析了CtaG及其多种突变体（如C11A, H128A, D144N）的高分辨率晶体结构（最高达1.4 ?），从而揭示了其独特的双结构域架构和催化腔室细节；采用等温滴定量热法（ITC）定量分析蛋白质-蛋白质相互作用；借助AlphaFold3进行蛋白质结构预测和复合物建模；并利用基于结构的基因组挖掘（使用Foldseek和DALI等工具）在多种天然产物生物合成基因簇中寻找同源酶，以探索其功能的普适性。

CtaG催化PCP结合底物间的酰胺键形成

研究人员首先通过严谨的体外生化实验确定了CtaG的底物要求。他们分别合成了游离的(βAla)₃及其与载体蛋白CtaE的复合物(βAla)₃-CtaE。实验结果表明，只有当(βAla)₃以PCP结合的形式存在时，CtaG才能催化其与CtaH提供的PHBA donor形成酰胺键产物(βAla)₃-PHBA。这 conclusively 证明CtaG的催化作用严格依赖于两个PCP结合的底物。

CtaG对供体和受体PCP具有选择性

为了探究CtaG是否区分不同的载体蛋白，研究团队制备了各种PCP-底物复合物（PHBA-CtaH, PHBA-CtaE, (βAla)₃-CtaH, (βAla)₃-CtaE）并测试了它们的组合。MALDI-TOF-MS分析显示，只有当PHBA由CtaH提供时，才能观察到+120 Da的质量偏移（对应于PHBA的转移）。而当PHBA由CtaE提供时，则无产物生成。相反，(βAla)₃无论由CtaE还是CtaH提供，均可作为亲核受体，但CtaE是更优的接受体。这些结果表明CtaG对其载体蛋白伙伴具有明确且不可互换的角色分配：CtaH是专一的PHBA供体，而CtaE是首选的受体。

CtaG以特定顺序招募供体和受体PCP

通过使用氯丙烯酰胺类电泳探针进行共价交联实验，研究人员进一步揭示了CtaG与PCP相互作用的方向性。结果表明，CtaG首先与供体PHBA-CtaH结合，形成二元复合物。在接受了PHBA并形成共价中间体后，CtaG发生构象变化，从而能够招募受体(βAla)₃-CtaE。这种有序的、分步的识别机制确保了反应的方向性和高效性。

CtaG的结构解析与催化机制阐释

由于CtaG的序列同源性极低，研究人员通过X射线晶体学解析了其高分辨率结构。结构显示CtaG呈单体形式，具有独特的双结构域架构：N端结构域包含一个混合的α/β折叠，而C端结构域形成一个紧凑的卷曲螺旋。两个结构域共同围成一个巨大的分子内空腔，并通过一个约8 ?的单一入口孔道与外界相连。更重要的是，结构分析揭示了一个经典的Cys¹¹-His¹²⁸-Asp¹⁴⁴催化三联体，这与木瓜蛋白酶（Cys-His-Asn）类似。空腔内的芳香族残基（Trp⁵⁰, Phe¹⁰⁵, Tyr¹⁴⁶, Tyr¹⁴⁷）构成了一个芳香族“门控”系统，通过π-π堆积相互作用稳定PHBA部分，并保护酶-底物中间体免受水解，确保了反应的向前进行。对一系列点突变体的结构分析（如C11A, H128A, D144N）证实了这些残基在维持结构完整性和催化功能中的关键作用。特别是Asp¹⁴⁴的突变导致了空腔结构的显著重组，凸显了其重要性。

基于生化数据和结构信息，研究提出了CtaG催化的“乒乓”机制：首先，PHBA从CtaH转移至CtaG的活性中心Cys¹¹，形成共价的CtaG-PHBA硫酯中间体；随后，受体PCP CtaE所携带的(βAla)₃的氨基亲核攻击该硫酯中间体，形成最终的酰胺键，完成远端链延伸，并将延伸后的产物留在CtaE上。整个过程通过单一的底物隧道进行方向性转移，其逻辑类似于固相肽合成（SPPS）。

结构同源性搜索揭示相关生物催化剂

通过结构引导的基因组挖掘，研究团队在petrobactin、butirosin和methylolanthanin等其他天然产物的生物合成基因簇中发现了CtaG的同源酶（如AsbE, BtrH, MIDE）。尽管序列同一性很低（<14%），但这些同源酶在整体折叠和催化三联体上表现出高度的结构保守性，表明CtaG所代表的是一类先前被忽视的、基于硫模板机制的肽连接酶，其催化策略在自然界中可能更为广泛存在。

本研究结论与讨论部分强调，CtaG介导的肽延伸机制代表了与经典NRPS逻辑的根本性背离。其通过“乒乓”机制和单一底物隧道实现远端底物加载和链延伸，提供了更高的灵活性。该研究不仅阐明了一种新的酶学机制，扩展了用于核糖体非依赖型酰胺键形成的催化工具箱，而且其发现具有广泛的生物学意义。通过结构基因组学发现CtaG的同源酶存在于多种不同的生物合成途径中，预示着这一机制在天然产物生物合成中的普遍性和重要性。这为未来发现更多由类似酶催化的新颖天然产物提供了线索。更重要的是，对CtaG工作机制的深入理解为合成生物学家提供了新的元件和设计原则，可用于设计和构建更高效、更模块化的非核糖体肽人工合成体系，从而加速新药先导化合物的发现与开发。