新型小鼠胆管癌肿瘤浸润淋巴细胞疗法模型的建立及其与PD-L1阻断的协同效应研究

《The Journal of Immunology》：Development of a murine tumor-infiltrating lymphocyte therapy model for cholangiocarcinoma

本研究针对胆管癌(CCA)免疫治疗耐药难题，开发了首个原位小鼠CCA肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗模型。研究人员通过比较CD3激动剂与肿瘤抗原两种TIL扩增方法，发现肿瘤抗原扩增的TILs具有更强的体外杀伤活性和体内持久性。更重要的是，当与PD-L1抑制剂联用时，TIL疗法显著延缓了肿瘤进展并提高生存率。该模型为优化过继性T细胞治疗(ACT)提供了重要平台，为临床联合免疫治疗策略提供了 preclinical 依据。

　　

胆管癌(Cholangiocarcinoma, CCA)是一种起源于胆管系统的侵袭性恶性肿瘤，其五年生存率不足20%，堪称消化系统肿瘤中的"硬骨头"。更令人担忧的是，超过60%的患者在确诊时已失去手术机会，只能依靠系统性治疗。近年来，尽管PD-1/PD-L1抑制剂联合化疗已成为晚期CCA的一线治疗方案，但原发性或继发性耐药问题依然突出，成为提高疗效的主要障碍。

在这一背景下，过继性T细胞治疗(Adoptive Cell Transfer, ACT)技术为CCA患者带来了新的希望。特别是肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs)疗法，已在黑色素瘤等实体瘤中展现出惊人疗效。个案报道显示，靶向ERBB2IP突变抗原的TILs甚至让一名转移性CCA患者实现了长达十余年的完全缓解。然而，将TIL疗法成功应用于CCA仍面临诸多挑战：如何获得足够数量且具有肿瘤特异性的TILs？如何提高TILs在体内的持久性和抗肿瘤活性？这些问题都亟待解决。

为了攻克这些难题，来自埃默里大学Winship癌症中心的研究团队在《The Journal of Immunology》上发表了创新性研究成果。他们成功建立了首个小鼠CCA原位TIL治疗模型，并探索了不同的TIL扩增策略及其与免疫检查点抑制剂的协同作用。

研究人员采用了几项关键技术：通过原位肝内注射URCCA4.3小鼠CCA细胞系建立肿瘤模型；利用流式细胞术全面分析肿瘤免疫微环境；比较CD3激动剂(CD3 TILs)与肿瘤抗原(含辐照自体肿瘤细胞，Tumor Ag TILs)两种TIL扩增方法；采用阻抗法(xCELLigence)评估TILs的体外细胞毒性；在免疫缺陷(Rag1^-/-)和免疫健全(C57BL/6)小鼠模型中评估TILs的体内疗效；探索TILs与PD-L1抑制剂的早期和晚期联合治疗策略。

肿瘤微环境中的T细胞特征

研究人员首先揭示了原位CCA肿瘤的免疫景观，发现CD45+免疫细胞约占活细胞的70%，其中CD3+T细胞超过30%。与癌旁肝组织相比，肿瘤内CD4+和CD8+T细胞表现出更高的活化状态，PD-1、CD44和CD69表达显著上调。更重要的是，肿瘤内存在大量祖细胞耗竭(Tpex)和终末耗竭(Tex)T细胞，提示这些T细胞虽然功能受限，但仍具有扩增潜力。

TILs的扩增与特性

研究团队成功建立了两种TIL扩增方案。令人鼓舞的是，Tumor Ag TILs相比传统CD3 TILs表现出更优的特性：中央记忆T细胞(T_CM)比例更高(37.40% vs 6.40%)，TNF-α分泌能力更强，且不倾向于终末分化(Tim-3+PD-1+比例低)。这些特征预示着Tumor Ag TILs可能具有更好的体内持久性和抗肿瘤活性。

体外细胞毒性优势

在体外杀伤实验中，Tumor Ag TILs的优势得到了充分验证。特别是在低效靶比(0.5:1和1:1)条件下，Tumor Ag TILs表现出显著优于CD3 TILs的细胞毒性。即使在二次肿瘤攻击实验中，Tumor Ag TILs仍能维持较强的杀伤能力，证明其具有持久的抗肿瘤活性。研究人员还通过对照实验排除了抗原呈递细胞对这一优势的干扰，确认肿瘤抗原的存在是提升TILs功能的关键因素。

体内治疗效果与联合策略

在免疫缺陷小鼠模型中，两种TIL疗法均能延缓肿瘤进展，但Tumor Ag TILs表现出更好的体内持久性，在输注25天后仍能在肿瘤组织、血液和淋巴结中检测到。值得注意的是，两种TILs都高表达PD-1，这为联合免疫检查点抑制剂提供了理论依据。

真正令人振奋的结果出现在联合治疗实验中。当TILs与PD-L1抑制剂联合使用时，无论是早期还是晚期给药，都能显著增强抗肿瘤效果。特别值得一提的是，Tumor Ag TILs联合PD-L1阻断治疗展现了最佳疗效，不仅显著延缓肿瘤生长，还呈现出改善生存期的趋势。这一发现具有重要的临床意义，因为PD-1/PD-L1抑制剂已是晚期CCA的标准治疗，将其与TIL疗法结合具有较好的临床转化前景。

这项研究的创新价值主要体现在三个方面：首先，建立了首个CCA原位TIL治疗小鼠模型，为后续研究提供了重要平台；其次，开发了基于肿瘤抗原的TIL扩增方法，能够获得更具肿瘤特异性和持久性的T细胞产品；最后，明确了TIL疗法与PD-L1抑制剂的协同作用，为临床联合治疗提供了理论依据。

当然，该研究也存在一定局限性，如使用的URCCA4.3肿瘤细胞系中髓系细胞浸润较少，与人类CCA高度免疫抑制的微环境存在差异。此外，虽然联合治疗显示出良好前景，但最佳的治疗时机和序列仍有待进一步探索。

展望未来，这一模型将助力科学家们开发更有效的TIL制造工艺，探索与其他免疫调节剂的联合策略，并最终推动个体化T细胞治疗在胆管癌领域的临床转化。随着更多优化策略的引入，TIL疗法有望成为攻克胆管癌这一难题的有力武器，为患者带来新的生存希望。