基于qPCR的LGA-PEI纳米颗粒载体在NIH/3T3细胞中质粒内化效率精准定量新方法的建立与验证

本文开发了一种基于qPCR的精准定量方法，通过优化DNA提取流程和建立质粒拷贝数检测体系，有效消除了聚合物LGA-PEI对qPCR的干扰，成功实现了对低转染效率纳米载体系统中内化质粒的定量分析，为非病毒载体开发提供了关键技术支持。

　　

亮点

我们验证了通过DNA提取和qPCR（定量聚合酶链式反应）检测来量化使用LGA-PEI（乳酸-乙醇酸共聚物修饰的聚乙烯亚胺）纳米颗粒转染的NIH/3T3细胞内化质粒拷贝数的方法。经过优化的qPCR和DNA提取检测表现出高线性度、灵敏度和稳健性。此外，我们开发了合适的提取和细胞外质粒消化方案，消除了qPCR反应中潜在的聚合物干扰，并提高了内化质粒定量的特异性。

引言

估算遗传物质转染效率最常用的方法基于通过荧光显微镜或流式细胞术检测的发光或荧光报告分子（例如GFP）。虽然这些方法简单快速[1][2][3][4][5][6]，但它们可能无法完全反映外源DNA的内化效率。这个问题在使用难转染细胞（如原代细胞[7][8][9][10]和一些永生化细胞系）时可能更为明显。

NIH/3T3细胞培养

NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞在补充了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（Gibco, 15070063）的DMEM培养基（Sigma, D5523）中培养。转染前，将15,000个（用于GFP检测）和50,000个细胞（用于DNA提取）分别接种到96孔板和24孔板上，并在37°C和5% CO₂条件下孵育24小时，以达到70%-80%汇合度（分别约为50,000和200,000个细胞）。对于转染，将96孔板和24孔板的培养基更换为80μL和400μL不含抗生素的DMEM。

qPCR方案评估

我们开发并优化了两套qPCR方案，用于推断细胞数量并定量样本中存在的质粒拷贝数。这些方案旨在确定3T3细胞中的质粒内化效率。

首先，我们使用纯化的基因组GAPDH（gGAPDH）扩增子（从先前扩增产物的琼脂糖凝胶对应条带中提取）来建立Ct值与gGAPDH扩增子拷贝数之间的相关性。

结论

对质粒和参考基因（基因组GAPDH）的qPCR分析显示出高线性度和效率，表明使用该方法可以可靠地确定质粒与细胞的比率。DNA提取方案在200,000至400,000个细胞之间具有可扩展性和稳健性，并保持了从至少每细胞50单位质粒开始的质粒与细胞比率。观察到质粒扩增受到聚合物的影响，但LGA-PEI不干扰游离质粒的提取，并且通过DNase I处理有效去除了细胞外质粒。