基于前照明表面等离子体共振(fiSPR)的生物传感器：揭示光响应蛋白动态互作机制的新工具

本研究针对光响应蛋白因激发态寿命短、需持续光照而难以进行实时互作动力学分析的难题，开发了一种新型前照明表面等离子体共振(fiSPR)生物传感器。该平台整合Kretschmann结构、透明微流控与光照模块，实现了对EL222二聚化及DNA结合过程的原位光照与实时监测，首次报道了其速率与平衡常数，并验证了“二聚化先于DNA结合”的假说。该技术为研究天然/工程化光响应蛋白（如光控白细胞介素受体）提供了强大工具，对光遗传学及生物医学应用具有重要价值。

　　

在生命的神秘世界里，光仿佛一把神奇的钥匙，能够瞬间激活某些蛋白质的功能。这类被称为光响应蛋白（Light-responsive proteins）的分子，广泛参与细菌的环境适应、植物的生长调控、动物的视觉与昼夜节律等关键生理过程。随着合成生物学的发展，工程化的光响应蛋白更成为了生物技术与医学研究中的明星工具，例如通过光照精确控制基因表达或细胞信号通路。然而，这些蛋白的“激活态”往往转瞬即逝——有的仅能维持几秒钟，且需要持续光照才能维持功能。这就给科学家们出了一个难题：如何在实际光照条件下，实时观察并精确测量它们与其他分子的相互作用？

传统的研究方法，如X射线衍射(XRD)、核磁共振(NMR)、光谱技术或电泳迁移率变动分析(EMSA)，虽然能提供宝贵的结构信息或平衡态结合数据，但大多无法实现真正意义上的实时动力学监测。表面等离子体共振(SPR)技术虽是生物分子互作动力学研究的“金标准”，却因传统SPR仪器的光学设计限制，难以在传感界面同时实现高质量的光学检测和样品原位照明。因此，开发一种能对光响应蛋白进行原位照明和实时监测的SPR平台，成为了一个重要的研究目标。

为了解决这一技术瓶颈，来自捷克科学院光子与电子研究所的Giusy Finocchiaro、Ji?í Homola等研究人员在《Biosensors and Bioelectronics》上发表了他们的最新成果。他们成功研制出一种新颖的前照明表面等离子体共振（front-illuminated SPR, fiSPR）生物传感器，并将其应用于蓝色光响应转录因子EL222和一种光控白细胞介素受体的研究，首次揭示了EL222二聚化及与DNA结合的动力学全过程。

为开展本研究，作者团队自主搭建了fiSPR传感平台，其核心技术方法包括：1）基于Kretschmann构型的SPR光学系统，采用光谱调制方式监测生物分子结合引起的折射率变化；2）定制化的透明微流控系统，其关键设计是包含一个孵育区和一个传感区，允许样品在流经传感芯片前先进行原位光照；3）可灵活更换的窄波段LED照明模块，能提供特定波长（300-700 nm）的激发光；4）参考通道补偿技术，用于扣除非特异性结合和背景干扰，确保检测准确性；5）对于蛋白-核酸互作分析，采用了两种不同的SPR分析策略（Assay 1和Assay 2）以研究不同的结合方向。

4.1. 光照对EL222–DNA系统的影响

研究人员首先证实了光照是EL222与共识DNA序列特异性结合的必要条件。在没有光照或使用乱序DNA（scrambled DNA）时，结合可忽略不计。通过系统测试不同波长（365-617 nm）和强度（0-3.3 mW/cm2）的照明，他们发现450 nm蓝光（强度3.3 mW/cm2）能最有效地激活EL222并引发最强的DNA结合反应，这与EL222内源黄素单核苷酸(FMN)生色团的吸收特性完全一致。

4.2. EL222与DNA相互作用的机制

为探究结合机制，团队设计了两类实验。其一（Assay 2）将EL222固定于芯片表面，然后使DNA流过，结果发现光照下的结合信号很弱，表明单个EL222激活态单体难以直接结合DNA。其二（Assay 1）将DNA固定，使EL222在微流控孵育区接受不同时间的光照后再流经传感面，发现结合信号随光照时间（最多260秒）延长而增强。紫外-可见吸收光谱(UV-vis)分析表明，不同光照时间下EL222的激活态单体比例相近，因此结合信号的增强被归因于光照时间促进了EL222二聚体的形成。后续实验证明，一旦停止光照，EL222会在几十秒内迅速恢复至无活性的暗态，这凸显了原位连续照明的极端重要性。

4.3. EL222二聚化的动力学分析

这是研究的一大亮点。通过将EL222固定于芯片表面，然后使不同浓度的EL222溶液流过并发生同源结合，研究人员成功监测了二聚化过程。动力学曲线无法用简单的1:1 Langmuir模型拟合。结合时间分辨红外光谱(TRIR)和对分离LOV结构域的研究，他们提出并验证了一个“两态结合模型”：两个EL222单体先快速形成一个瞬态二聚体(D1)，随后再缓慢重排为一个更稳定的二聚体构象(D2)。通过复杂的数据拟合（采用溶液中的平衡单体浓度[M]_eq进行计算），他们首次报道了这两个步骤的速率常数和平衡解离常数(K_D)。其中，D1形成的结合速率常数(k_a ≈ 1.68 × 103 M?1s?1)与之前瞬态光栅(transient grating, TG)光谱测得的结果高度吻合。

4.4. EL222二聚体与DNA相互作用的动力学分析

在证实二聚体是DNA结合的功能单元后，研究人员在DNA固定化的芯片上，分析了不同浓度EL222二聚体（[D]_eq）的结合过程。数据符合1:1 Langmuir模型，他们由此精确测得了EL222二聚体与DNA结合的动力学参数(k_a, k_d)和平衡解离常数(K_D ≈ 0.70 μM)。该K_D值与通过EMSA测得的半最大效应浓度(EC₅₀)非常接近。作为对比，他们使用商品化的生物膜干涉(BLI)系统进行了类似实验，但由于BLI无法实现传感过程中的原位照明，其测得的结合速率显著偏低，这反过来凸显了fiSPR技术平台的独特优势。所有这些发现共同支持了EL222先二聚化、再结合DNA的“二聚体路径”假说。

4.5. IL-20R2-Y70NBY与IL-24相互作用的研究

为展示fiSPR平台的普适性，研究人员将其应用于一个合成生物体系：一种经基因密码扩展技术引入光笼酪氨酸(ortho-nitrobenzyl-tyrosine, NBY)的白细胞介素受体突变体IL-20R2-Y70NBY与其配体IL-24的相互作用。结果清晰显示，只有在365 nm紫外光照射下，IL-24才能与固定在芯片上的受体突变体有效结合，而在黑暗中则无此作用，成功演示了fiSPR在研究工程化光控蛋白中的强大能力。

综上所述，本研究成功地开发并验证了一种功能强大的fiSPR生物传感平台。它巧妙地解决了在SPR检测中同时对样品进行原位照明的技术挑战，为研究具有短寿命激发态的光响应蛋白的相互作用动力学打开了一扇新的大门。研究者利用该平台首次完整解析了光响应转录因子EL222从光激活、二聚化到最终与DNA结合的动态全过程，获得了此前任何技术都难以测得的精确动力学参数，并有力地支持了“二聚化先于DNA结合”的作用机制。更重要的是，该技术不仅适用于EL222等天然光感受器，也同样适用于IL-20R2-Y70NBY等合成生物体系。这项研究是生物传感技术与前沿合成生物学/光遗传学领域的一次深度融合，其提供的fiSPR平台预计将成为推动光控蛋白质、 optogenetics（光遗传学）工具开发及其在生物医学应用中发展的一个宝贵工具。