新型静脉注射免疫球蛋白Yimmugo?中外源因子安全性验证：生产工艺对病毒和朊病毒清除效能的综合评估

本文针对静脉注射免疫球蛋白(IVIG)生产中潜在病原体污染风险，系统验证了新型制剂Yimmugo?生产工艺对病毒和朊病毒的清除能力。研究表明其包含的辛酸处理、低pH孵育、阴离子交换层析和纳米过滤四步正交纯化步骤可有效清除包膜/非包膜病毒及朊病毒，累计降低病原体载量≥10 log10，为免疫缺陷患者提供了具有高生物安全性的创新疗法。

　　

静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)是治疗原发性和继发性免疫缺陷综合征的重要生物制剂，同时在自身免疫性和炎症性疾病中也展现出显著临床效益。随着临床应用范围的拓展和市场需求的持续增长，确保这类血液制品的安全性显得尤为重要。尽管血浆筛选和病毒检测技术不断进步，但由于人源血浆本身可能携带传染性病原体，生产工艺中必须包含有效的病原体清除步骤，这是保障患者用药安全的关键环节。

在此背景下，Biotest AG公司开发了新型IVIG制剂Yimmugo?，其创新之处在于采用同步分离工艺，可从同一血浆池中同时获得IVIG和IgM浓缩物(trimodulin)两种免疫球蛋白产品。这种工艺不仅提高了血浆利用率，还减少了资源浪费。但与此同时，双产品生产线对病原体清除能力提出了更高要求。为了全面评估该产品的生物安全性，研究人员开展了一项系统研究，验证其生产工艺对病毒和朊病毒的清除效能，相关成果发表在《Current Research in Biotechnology》上。

本研究采用了多种关键技术方法，包括：(1)使用代表性病毒株（HIV、BVDV、PRV、HAV、PPV、B19V、HEV等）进行工艺步骤的病毒清除验证；(2)采用仓鼠适应性 scrapie 毒株263K作为朊病毒模型进行清除评估；(3)通过细胞感染性试验和qPCR方法分别测定病毒滴度；(4)运用Western blot和动物生物测定法检测朊蛋白；(5)建立符合EMA指导原则的缩小模型进行工艺验证。所有实验均使用符合PMF标准的血浆原料。

材料与方法

研究团队选取了涵盖包膜和非包膜病毒的多株病毒，包括HIV、PRV（乙肝病毒模型）、BVDV（丙肝病毒模型）、HAV、PPV以及B19V和HEV。通过细胞培养扩增病毒并制备高滴度病毒储备液，采用终点滴定法和大体积铺板法测定病毒滴度。对于无法进行感染性测定的B19V和HEV，则采用qPCR方法检测基因组病毒滴度。

结果

Yimmugo生物安全性的常规预防措施

研究表明，Yimmugo生产过程中使用的生物源材料均经过严格筛选，仅人源血浆存在潜在病原体风险。通过血浆主文件(PMF)合规血浆的使用、个体捐献层级HIV/HBV/HCV血清学检测、迷你池和制造池层面的PCR检测等多重安全措施，最大限度降低了病原体污染风险。

病毒清除方法

Yimmugo生产工艺包含四个关键病原体清除步骤：辛酸(CA)处理、低pH处理、阴离子交换层析(AEX)和纳米过滤。这些步骤基于不同的工作原理（化学灭活、电荷分离和尺寸排阻），形成了正交的清除策略。

辛酸处理

实验证明，辛酸处理能有效灭活包膜病毒（HIV≥5.64 log₁₀、BVDV≥5.97 log₁₀、PRV≥6.21 log₁₀），同时对非包膜病毒HAV(≥4.39 log₁₀)和HEV(≥4.96 log₁₀)也有良好清除效果。动力学研究表明，即使在低于工艺要求的辛酸浓度下，病毒灭活也能在60分钟内完成，表明该步骤具有充分安全余量。

低pH处理

低pH处理( pH 4.0)对HIV表现出高效灭活能力(≥6.63 log₁₀)，对PRV也有显著效果(≥4.31 log₁₀)。但考虑到PRV对低pH的耐受性可能低于其模拟的HBV，研究人员谨慎地未将这部分数据纳入最终评估。

阴离子交换层析

AEX层析主要针对非包膜病毒，在worst-case条件下仍能有效去除HAV(≥3.95 log₁₀)、B19V(≥5.86 log₁₀)和PPV(3.21 log₁₀)。该步骤通过电荷差异实现病毒分离，而非灭活作用。

纳米过滤

纳米过滤采用Asahi BioEX滤器（孔径约20nm），对所有测试病毒均表现出高效去除能力（HIV≥4.72 log₁₀、BVDV≥4.72 log₁₀、HAV≥4.37 log₁₀、EMCV≥4.93 log₁₀、B19V≥4.33 log₁₀、PPV 6.12 log₁₀）。即使在小尺寸病毒如PPV和B19V的去除方面也表现优异。

传染性海绵状脑病病原体的减少

针对朊病毒的清除研究表明，辛酸处理可提供≥3.85 log₁₀（体外）和5.99 log₁₀（体内）的朊病毒减少。结合AEX层析(2.6 log₁₀)和纳米过滤(≥4.0 log₁₀)的预估清除能力，整个工艺可提供≥10.45-12.59 log₁₀的朊病毒总清除率。

讨论与结论

本研究系统验证了Yimmugo生产工艺对病原体的清除能力。该工艺包含四个基于不同原理的正交清除步骤：两个化学灭活步骤（辛酸处理和低pH处理）主要针对包膜病毒，两个物理分离步骤（AEX层析和纳米过滤）则能有效去除包括小型非包膜病毒在内的各类病原体。这种多机制组合策略不仅对已知病毒有效，也为应对潜在新发病毒提供了安全保障。

特别值得关注的是，研究发现辛酸处理不仅能灭活包膜病毒，还能通过沉淀作用去除非包膜病毒；纳米过滤对所有测试病毒（包括最难清除的小型 parvoviruses）都表现出高效去除能力；低pH处理则对HIV等包膜病毒有快速灭活作用。对于朊病毒这种特殊病原体，工艺也展示了显著的清除能力。

这些研究结果证实，Yimmugo生产工艺能够为免疫缺陷患者提供安全可靠的IVIG产品。其创新性的双产品生产线（同步生产IVIG和IgM浓缩物）在保证安全性的同时，提高了血浆利用效率，为血液制品行业提供了新的发展思路。四步正交病原体清除策略的成功验证，也为其他生物制品的安全生产提供了有价值的参考。