多组学解析双酚A诱导肝纤维化机制：PPARγ下调与AKT1/FN1信号通路的因果证据

本研究针对环境内分泌干扰物双酚A(BPA)与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病机制的因果关系，通过整合孟德尔随机化(MR)分析、单核RNA测序(snRNA-seq)和网络毒理学等多层次研究手段，首次发现BPA通过下调PPARγ和激活AKT1/FN1信号通路促进肝星状细胞活化及细胞外基质重塑的分子机制。研究不仅证实了BPA暴露与NAFLD风险的遗传因果关系(β=0.68, P<5×10?10)，还通过体外实验验证了环境相关浓度BPA(10 nM–1 μM)可诱发氧化应激、线粒体功能障碍和胶原沉积，为BPA的代谢纤维化作用提供了机制性证据，对NAFLD的防治具有重要指导意义。

　　

随着生活方式和饮食结构的改变，非酒精性脂肪肝病(NAFLD)已迅速攀升为全球最常见的慢性肝脏疾病，影响约三分之一的成年人群体，且发病年龄呈现年轻化趋势。从单纯的肝脏脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，进而发展为肝纤维化，这一疾病谱系中的纤维化程度是决定患者肝脏相关死亡率和全因死亡率的最强组织学预测指标。尽管代谢肝病学领域取得了显著进展，但有效的药物治疗方案仍然有限，当前的管理策略主要依赖于生活方式干预，而其依从性和持久性却不尽如人意。这些治疗缺口凸显了需要识别超越经典代谢危险因素的可改变疾病驱动因素的重要性。

近年来，越来越多的证据表明环境暴露是NAFLD发病机制中未被充分认识的影响因素。在众多内分泌干扰化学物(EDCs)中，双酚A(BPA)因其在聚碳酸酯塑料和环氧树脂中的广泛使用，以及随之而来近乎普遍的人类暴露而备受关注。全国生物监测反复在绝大多数尿液样本中检测到BPA，而血液和组织中的可测量水平则表明存在系统和慢性暴露。从机制上讲，BPA能够与多种核受体相互作用——包括雌激素受体和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)——从而重新编程与脂质处理、胰岛素信号和炎症反应相关的转录程序。这些受体层面的效应与氧化应激通路相交织，促进活性氧(ROS)生成和氧化还原敏感的炎症级联反应，这些都与脂肪性肝炎和纤维化发生密切相关。

肝纤维化是代谢性肝病中最强的不良结局预测指标，而肝星状细胞(HSCs)是主要的纤维化效应细胞。在损伤相关信号（包括细胞因子、脂质过氧化产物和机械应力）的作用下，静止的、储存维生素A的HSCs转分化为具有收缩性、增殖性的肌成纤维细胞，这些细胞沉积胶原和其他细胞外基质成分。最近的单细胞和系统研究强调了HSCs的异质性和可塑性，它们与肝细胞和巨噬细胞的交互作用，以及TGF-β/Smad和整合素-FAK-AKT信号轴在维持纤维化程序中的核心作用。这些见解将HSCs置于代谢应激和环境毒物可能汇聚加速瘢痕形成的关键节点。

传统的毒理学研究高度依赖高剂量动物模型和单一终点读数，难以解析像NAFLD这样的多因素条件下复杂的暴露-疾病关系，且超生理剂量限制了其转化相关性。互补的方法学进展为弥合这一差距提供了途径。孟德尔随机化(MR)利用暴露的种系代理变量来加强因果推断；细胞类型解析的单细胞转录组学可以在肝脏生态系统内绘制暴露响应程序；加权基因共表达网络分析(WGCNA)突出显示与性状相关的模块和候选枢纽；网络毒理学与分子对接将化学-蛋白质相互作用组与结构亲和力对齐，生成可测试的机制预测。然而，这些方法很少被联合用于在人类相关背景下探究环境驱动的纤维化发生。

针对这一研究空白，合肥市第三人民医院内分泌科的研究团队在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了题为"Mechanistic insights into bisphenol A – Induced liver fibrosis: Evidence of PPARγ downregulation and AKT1/FN1 signaling from multi-level analysis"的研究论文，通过实施一个整合的多层次策略，评估环境BPA可能如何扰乱与NAFLD相关的肝脏回路。

研究人员综合运用了几项关键技术方法：利用来自30万参与者的公开GWAS汇总统计数据进行了两样本孟德尔随机化(MR)分析；重新分析了42个人类肝脏样本的单核RNA测序(snRNA-seq)数据；采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)和网络毒理学方法识别关键基因模块；通过分子对接模拟评估BPA与关键蛋白的结合亲和力；最后使用LX-2肝星状细胞系进行体外验证实验，暴露于环境相关浓度的BPA(10 nM–1 μM)。

3.1. 遗传证据支持BPA暴露与NAFLD风险之间的因果关系

通过两样本孟德尔随机化分析，研究人员评估了基因代理的双酚A(BPA)暴露对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的影响。从IEU Open GWAS(ubm-b-942；欧洲队列的尿液BPA)中提取BPA工具变量，选择了156个独立的全基因组显著SNPs(P < 5×10^?8，在10 Mb内以r2<0.01进行聚类)。结果汇总统计数据来自FinnGen Release 12(finngen_R12_NAFLD；>30万参与者)。 multiplicative随机效应IVW估计器显示正相关(β=0.71, SE=0.11, p = 4.60×10^?10)。加权中位数(β=0.99, SE=0.16, p = 3.63×10^?10)和加权众数(β=1.16, SE=0.23, p = 1.27×10^?6)估计器也显示一致效应。MR-Egger斜率在方向上保持一致(β=1.11, SE=0.28, p = 1.05×10^?4)，尽管不确定性更大，支持对违反"无多效性"假设的稳健性。

3.2. NAFLD肝细胞的质量控制、降维和细胞类型注释

为了研究与NAFLD进展相关的细胞异质性和分子扰动，研究人员使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析了GEO数据集GSE212837，涵盖了来自对照和NAFLD状态的9个个体样本的肝组织。进行了严格的质量控制过滤，基于RNA含量(nCount_RNA)、基因多样性(nFeature_RNA)和线粒体/核糖体基因百分比排除低质量细胞和双细胞。选择了2000个高分散基因进行下游分析。使用SingleR算法针对人类原代细胞图谱参考分配细胞类型注释。

3.3. NAFLD肝脏中的细胞组成和差异基因表达模式

研究人员首先量化了供体和条件间的组成变化。供体水平比例显示，与对照组相比，NAFLD/NASH中单核细胞和祖细胞样细胞富集，纤维化肝脏中单核细胞负荷最高——这与激活星状细胞的炎症环境一致。肝细胞、胆管细胞和内皮细胞显示出更温和的、阶段依赖性变异，而星状细胞分数在较高纤维化阶段的样本中增加。差异表达使用MAST对SCTransform残差进行分析，火山图和热图将对照与NAFLD转录组分开，突出了FN1、HSP90AA1和AKT1在间充质/免疫区室中的上调。

3.4. 伪时间和细胞间通信分析揭示NAFLD中的单核细胞-祖细胞动态

为了增加BPA特异性，研究人员将NAFLD DEGs与比较毒物基因组学数据库(CTD)的BPA-基因注释相交，然后使用CellChat v1.6.1和CellPhoneDB v2.1.7绘制细胞间信号。显著回路——PDGFB–PDGFRB、TGFB1–TGFBR1/2、FN1–ITGA5/ITGB1、CCL2–CCR2(所有FDR<0.05)——定义了星状细胞-巨噬细胞和星状细胞-肝细胞轴，与AKT1–FN1为中心的促纤维化程序、肝细胞PPARγ抑制和ECM重塑一致。

3.5. WGCNA揭示与NAFLD进展相关的关键基因模块

通过加权基因共表达网络分析(WGCNA)使用整合的转录组数据集(GSE205645、GSE200765、GSE85547)，研究人员识别了与NAFLD相关的基因模块。首先，选定样本的无监督层次聚类揭示了NAFLD和对照组织之间不同的转录组谱。为了实现稳健模块检测所需的无标度拓扑，选择了最佳软阈值功率9，实现了超过0.85的无标度拓扑拟合指数(R2)。模块-性状关系通过计算模块特征基因与临床特征之间的Pearson相关系数进行量化。 turquoise模块显示与NAFLD诊断最强的正相关(r = 0.82, p = 3e-06)，表明它包含了疾病进展中关键基因。

3.6. 网络毒理学和分子对接揭示BPA诱导肝毒性的潜在机制

为了阐明双酚A(BPA)促进非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病机制的分子机制，研究人员采用了全面的网络毒理学方法，整合了化合物-靶点映射、功能富集、枢纽基因优先排序、单细胞验证和分子对接分析。通过重叠CTD、DrugBank、ToxCast和PubChem数据库的结果，确定了1958个潜在的BPA相关靶点。这些靶点与先前WGCNA和单细胞转录组分析获得的关键基因相交，产生了124个共享基因，这些基因同时涉及BPA暴露和NAFLD病理。

3.7. 连接核受体扰动和基质信号的六基因枢纽

为了提名核心调节因子，在机制上连接BPA暴露与NAFLD生物学，研究人员使用cytoNCA(Cytoscape)对策划的PPI网络进行基于拓扑结构的优先排序，整合了Betweenness、Closeness、Degree和Eigenvector中心性。六个基因——PPARG、AKT1、FN1、HSP90AA1、CAV1、ESR1——在所有指标中始终排名前层级，并通过集合交集确认。单核转录组验证支持枢纽集的细胞类型限制性表达。PPARG和AKT1在肝细胞和肝星状细胞(HSCs)中富集，与肝细胞中脂质程序衰减和间充质区室中AKT1–FN1扩增一致，而ESR1和HSP90AA1在Kupffer和内皮群体中显示更广泛的分布。

3.8. LX-2细胞中BPA诱导毒理学通路的细胞实验验证

为了确认从生物信息学和网络毒理学分析中得出的分子特征，研究人员使用人肝星状细胞系LX-2进行了体外验证，暴露于浓度递增的BPA(10 nM、100 nM、1 μM)48小时。Western blot分析支持了六个关键靶点蛋白质表达的剂量依赖性改变。值得注意的是，PPARγ水平随着BPA浓度增加而显著降低，表明其抑制。相反，AKT1、FN1、HSP90、CAV1和ESR1显著上调，在1 μM BPA组中观察到最高的蛋白质表达。

研究结论和讨论部分强调了这项多层次研究的严谨性和创新性。通过整合孟德尔随机化、单核转录组学、网络毒理学、对接和体外纳米摩尔暴露验证，研究结果支持了常规BPA暴露通过减弱肝细胞PPARγ程序和参与AKT1–FN1应激-纤维化回路而促进NAFLD的假设。

从机制上讲，BPA促进肝脏炎症，包括Kupffer细胞的M1极化，从而放大NAFLD中单核细胞/巨噬细胞驱动的细胞因子环境。在高级别损伤中，肝祖细胞(HPCs)被激活并与疾病活动和纤维化阶段相关。中央机制主题是核受体干扰。跨数据集和分析，BPA减弱了PPARγ活性：对接和最近的结构工作表明，BPA占据PPARγ配体结合域靠近Cys285但未能稳定螺旋-12(Tyr473)，阻止了完全激动作用。一致地，转录组学和报告基因读数显示PPARγ靶点（包括CPT1A）下调，β-氧化抑制，同时脂生成程序互惠增加，与通过PPARγ/RXR回路介导的"肥胖原"概念一致。

第二个机制支柱是氧化应激依赖性脂毒性。在肝细胞培养中，BPA显著增加ROS(DCFH-DA)并上调脂肪酸转位酶CD36，同时伴有三酰甘油积累。与N-乙酰半胱氨酸(NAC)共同处理使ROS正常化并降低CD36表达和脂质负荷，表明ROS→CD36因果轴。这些观察结果与报告一致，即BPA，特别是与膳食脂肪一起，通过ROS诱导的CD36过表达驱动脂肪变性，并与NAFLD共识模型一致，其中氧化还原失衡加速脂质过氧化和Kupffer细胞激活。

这些见解提出了转化途径：(i)PPARγ激动剂(如吡格列酮)可能对抗BPA引起的代谢抑制；(ii)AKT/PDGF信号抑制剂值得评估作为抗纤维化策略；(iii)干扰纤连蛋白/EV通路可能减轻基质积累。在生物标志物方面，我们BPA响应模块中的炎症蛋白——如S100A8/A9(钙保护素)和VCAN(多功能蛋白聚糖)——越来越多地与代谢炎症和脂肪变性相关，可以作为EDC相关肝损伤的循环指标进行探索。

研究结果还与监管政策相交织。欧洲食品安全局(EFSA)最近在全面重新评估后将BPA的每日可耐受摄入量降低至0.2 ng/kg bw/天，欧盟委员会已通过禁止在食品接触材料中使用BPA的决定(2025年生效)，反映了对低剂量风险日益增长的关注。与美国长期的参考剂量背景(50 μg/kg/天)一起，这些行动强调需要根据肝脏代谢和纤维化的机制数据重新评估暴露限值。

然而，该研究有几个局限性：MR分析主要依赖于欧洲血统GWAS，可能限制普适性；未模拟真实世界的混合物共同暴露；从对接和转录组学推断的靶点参与缺乏生化确认。为了解决这些差距，未来的工作应该整合空间肝脏组学以解析分区特异性效应，并部署更好地重现多细胞肝脏生态学和慢性暴露动态的类器官/人源化模型。