无外源成分红细胞分化方案实现镰状细胞病的体细胞来源iPSC建模

本研究开发了一种优化的无外源（xeno-free）三阶段红细胞分化方案，通过使用聚乙烯醇（PVA）替代传统牛血清白蛋白（BSA），成功从健康供体和镰状细胞病（SCD）患者体细胞来源的诱导多能干细胞（iPSCs）中生成具有成熟β-珠蛋白表达、可自然脱核的红细胞（iRBCs）。该模型在低氧条件下再现镰变表型，RNA测序揭示血红蛋白调控异常与氧化应激通路失调，为SCD疾病机制研究和个体化治疗开发提供了强有力的体外平台。

　　

亮点（Highlights）

• 人类iPSC提供多系分化潜力，但模拟红细胞疾病如镰状细胞病（SCD）常因产生不成熟、缺乏β-珠蛋白（β-globin）且脱核效率低的红细胞而受阻。

• 我们提出一种优化的三阶段无外源（xeno-free）方案，使用聚乙烯醇（PVA）从健康供体和SCD供体生成脱核的β-珠蛋白阳性红细胞。

• SCD iRBC在低氧条件下发生镰变，RNA测序（RNA-seq）显示血红蛋白调控和氧化应激通路发生改变。

• 该方法支持患者特异性iRBC生产，可用于SCD体外建模和治疗开发。

引言（Introduction）

镰状细胞病（SCD）是一种由β-珠蛋白基因（HBB^Glu6Val）单碱基突变引起的先天性血液疾病。临床上表现为严重贫血、组织氧合减少以及疼痛的血管阻塞危象，导致全身组织损伤和死亡风险增加。患者症状在出生后出现，此时骨髓祖细胞内发生称为珠蛋白转换的转录现象，启动成人β-珠蛋白基因表达，并下调胎儿γ-珠蛋白表达。这一遗传转换导致成人血红蛋白四聚体蛋白HbA的产生，它为循环红细胞提供携氧功能。在携带镰状突变的患者中，循环红细胞含有突变型HbS蛋白复合物。HbS变体具有降低的表面负电荷和疏水性丧失，使其在脱氧后聚合，将双凹形红细胞变形为致病的“镰状”细胞形状。

尽管已有新批准的基因疗法治疗SCD，以及同种异体骨髓移植的治愈效果，但这些干预措施风险巨大、费用高昂，并非对所有患者都可用或适合。大多数SCD患者依赖终身输血，或选择FDA批准的疗效不一且副作用挑战较大的药物，如羟基脲和Crizanlizumab。因此，需要更准确的人源化SCD模型，以重现复杂的红细胞表型和疾病遗传背景，从而开发更稳健、个性化的治疗方法。

传统体外重现人类红细胞生成的方法依赖于具有红系表型的永生化细胞系，如HUDEP-2和BEL-A细胞，或需要从捐赠的骨髓、外周血或脐带血中提取短寿命CD34⁺祖细胞进行红系分化。由于常见动员剂（如G-CSF）的不良反应，从SCD患者获取CD34⁺细胞历来具有挑战性，这限制了疾病体外建模和患者特异性治疗设计所需造血材料的获取。虽然健康供体的CD34⁺细胞可通过基因操作模拟SCD表型，但这种做法忽略了更大的遗传背景，这些背景导致了患者症状复杂性、严重程度及药物反应的异质性。由于这些挑战，需要一种体外平台，使人类血红蛋白病能够在更患者特异性的水平上进行研究，这是永生化细胞系、人源化小鼠模型或脐血来源祖细胞目前无法提供的。

诱导多能干细胞（iPSCs）可从易于获取的体细胞来源产生，如白细胞（PBMC）或废弃组织（如拔出的智齿）中的成纤维细胞。利用许多明确或商业可用的体外造血方法，从SCD患者制备的iPSC可提供几乎无限的携带镰状突变的CD34⁺造血祖细胞。然而，随后向终末成熟红细胞的分化在iPSC模型中迄今仍很困难，因为它们通常呈现未成熟的红系免疫表型，产生较少的脱核细胞，且主要表达胚胎和胎儿珠蛋白。红系培养中需要稳健的β-珠蛋白表达和高脱核率，以证明SCD的核心病理特征，从而作为准确的体外疾病模型。

在此，我们描述了一种优化的细胞培养方案，用于从健康供体和纯合子SCD患者体细胞来源的iPSC生成诱导红细胞（iRBC）。该方案用于构建人类SCD体外模型，由脱核、HbSS阳性、形态学镰变的iRBC组成，模拟了红细胞病理学的多个方面。此外，该方案证明常见的外源培养成分牛血清白蛋白（BSA）可被合成、无毒、无外源的替代品聚乙烯醇（PVA）取代，显著提高总细胞产量并产生同等成熟的iRBC。这种新颖的无外源分化方案建立了一个改进的平台，用于从体细胞来源iPSC体外生产患者特异性iRBC，可作为人类血红蛋白病的模型，用于开发和测试新疗法以改善患者健康。

讨论（Discussion）

多个研究小组已开发了从各种原始来源体外生成红细胞的方案，并且随着我们对红细胞生成理解的深入，这些方案可能会继续演变。本项目的目的有两个：首先，优化一种培养方案，使其能够使用源自体细胞的人类iPSC在体外工程化成熟、血红蛋白化的iRBC；其次，利用该方案生成一种新的人类SCD模型，具有重现疾病相关表型和分子特征的能力。