布鲁塞尔芽孢杆菌（Brettanomyces bruxellensis）对山梨酸的耐受性及其在低糖软饮料变质过程中的代谢作用

《International Journal of Food Microbiology》：Sorbic acid resistance and metabolism of Brettanomyces bruxellensis in the spoilage of low sugar soft drinks

研究揭示了酿酒酵母Brettanomyces bruxellensis在低糖饮料及含苯甲酸（SA）环境中具有强适应能力。通过比较不同糖浓度和SA浓度下的生长曲线，发现该酵母在0.1%葡萄糖条件下仍能高效生长，且SA抗性与其呼吸代谢产生的ROS水平相关。单细胞分析显示，高ROS亚群对SA更耐受，而抗氧化剂NAC可降低ROS并增强SA敏感性。实验还验证了该酵母在多种低糖饮料及含糖替代品中的生长能力。这些发现为低糖食品的防腐策略提供了新视角。

　　随着全球消费者对健康饮食的关注增加，以及各国实施的糖税政策，低糖或无糖饮料的市场正在迅速扩大。这一趋势不仅改变了饮料行业的配方，也对食品和饮料的微生物安全提出了新的挑战。近年来，研究发现一些耐受性强的酵母菌株可能在低糖环境中展现出显著的生长能力，其中，Brettanomyces bruxellensis（布鲁氏酵母）作为一种新兴的腐败菌，其在低糖乙醇发酵过程和酒精饮料中的生长特性已引起广泛关注。然而，关于其在非酒精类低糖饮料中的生长潜力及耐受性，仍缺乏系统的科学探究。本研究旨在填补这一知识空白，评估B. bruxellensis在低糖饮料中的生长能力，以及其对主要食品防腐剂——富马酸（sorbic acid, SA）的耐受性。

### 低糖饮料的背景与挑战

低糖饮料的流行是由于消费者对糖分摄入的担忧，以及政府和企业为满足健康需求而推行的低糖配方。这种转变对饮料生产提出了更高的技术要求，尤其是在控制微生物污染方面。传统的食品防腐剂如富马酸，因其对某些腐败菌的抑制效果而被广泛使用。然而，研究表明，某些酵母菌株，如Zygosaccharomyces parabailii和Saccharomyces cerevisiae，能够通过调整其碳代谢方式（从呼吸代谢转向发酵代谢）来增强对富马酸的耐受性。这种适应性可能使它们在低糖环境中更具生存优势。

因此，本研究的重点在于评估B. bruxellensis是否具有类似的适应能力，能够在低糖饮料中生长并抵抗富马酸的抑制作用。此外，研究还关注该酵母菌株在不同营养条件下的生理特性，以及其细胞内活性氧（ROS）水平与富马酸耐受性之间的潜在联系。

### Brettanomyces bruxellensis在低糖环境中的生长能力

在实验中，B. bruxellensis被测试在不同浓度的葡萄糖（2%和0.1%）条件下以及富马酸存在时的生长表现。结果表明，该酵母菌株在低糖环境中仍能良好生长，其生长速率与常见腐败菌Z. parabailii相似，甚至在某些情况下表现出更高的生物量积累能力。在零糖柠檬水、低糖果汁和碳酸饮料等多样化的饮料配方中，B. bruxellensis均展现出较强的生长能力，这表明其可能具备适应多种非酒精饮料环境的潜力。

值得注意的是，B. bruxellensis在低糖条件下的生长能力与其主要依赖呼吸代谢的特性密切相关。尽管在低糖条件下，呼吸代谢通常会导致生长速度下降，但B. bruxellensis却能够维持相对稳定的生长速率，这可能是其在低糖饮料中具有较强生存能力的原因之一。此外，实验还发现，B. bruxellensis对富马酸表现出显著的耐受性，即使在高浓度（如1 mM）下，其生长仍未受到明显抑制。这一结果表明，B. bruxellensis可能具备某种机制，使其在富马酸存在时仍能维持正常的代谢活动。

### 富马酸耐受性的机制探讨

富马酸是一种常见的食品防腐剂，其作用机制主要与抑制细胞呼吸和引发氧化应激有关。然而，实验发现B. bruxellensis对富马酸的耐受性远高于主要依赖发酵代谢的酵母菌株S. cerevisiae。这一现象引发了研究者对富马酸耐受性机制的深入思考。

通过单细胞分析，研究发现B. bruxellensis在低糖条件下的细胞内ROS水平存在显著的异质性。在0.1%葡萄糖条件下，高ROS水平的细胞亚群表现出更强的富马酸耐受性，而低ROS水平的细胞则更容易受到富马酸的抑制。这一结果提示，ROS可能在B. bruxellensis对富马酸的耐受性中扮演重要角色。虽然ROS通常被视为细胞毒性物质，但在某些情况下，它们可能具有促进细胞适应环境的能力。例如，富马酸诱导的氧化应激可能激活细胞内的抗氧化系统，而高ROS水平的细胞可能已经具备更强的抗氧化能力，从而在富马酸存在时表现出更高的生存率。

为了进一步验证这一假设，研究者使用了抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）来降低细胞内的ROS水平。结果表明，NAC的添加显著增强了B. bruxellensis对富马酸的敏感性，尤其是对原本具有高ROS水平的细胞亚群。这说明，ROS水平的差异可能是B. bruxellensis对富马酸产生不同反应的原因之一。高ROS水平的细胞可能已经通过呼吸代谢产生的氧化应激激活了自身的抗氧化机制，从而具备更强的富马酸耐受性。

### 低糖饮料中的其他成分影响

除了富马酸，低糖饮料中还可能含有其他成分，如人工甜味剂（如甜叶菊苷、糖精、阿斯巴甜和蔗糖酯）。这些成分通常被用作传统糖分的替代品，以减少热量摄入并满足消费者的口味需求。然而，实验结果显示，这些人工甜味剂对B. bruxellensis的生长没有显著促进作用，甚至可能抑制其生长。这表明，B. bruxellensis在低糖饮料中的生长可能依赖于其他营养成分，而非人工甜味剂。

因此，研究者推测，B. bruxellensis可能通过利用饮料中的其他可利用碳源（如有机酸、维生素或矿物质）来维持其生长。这种代谢灵活性可能是其在低糖环境中生存的关键因素之一。然而，目前的研究尚未完全揭示B. bruxellensis在复杂饮料配方中的具体营养利用途径，这为未来的深入研究提供了方向。

### 生长环境的氧气依赖性

富马酸的耐受性与氧气供应密切相关。实验发现，B. bruxellensis在低氧条件下的生长显著受限，而在高氧环境下则表现出较强的生长能力。这一现象与该酵母菌株主要依赖呼吸代谢的特性一致。呼吸代谢通常需要氧气作为电子受体，而发酵代谢则可以在无氧条件下进行。因此，B. bruxellensis在低氧条件下可能无法有效进行呼吸代谢，从而影响其生长速率。

然而，富马酸的耐受性并不完全依赖于呼吸代谢。尽管该酵母菌株在低氧条件下表现出较低的生长能力，但其对富马酸的耐受性却并未显著下降。这表明，富马酸的耐受性可能涉及其他机制，如细胞膜的结构适应、代谢通路的调整或抗氧化系统的增强。此外，研究还发现，即使在低氧条件下，B. bruxellensis仍能维持一定的呼吸活性，这可能与其在低糖环境中生存的适应性有关。

### 单细胞异质性与耐受性的关系

单细胞异质性是近年来微生物研究中的一个重要概念，指的是同一基因型的细胞群体中，不同个体在生理和代谢特性上的差异。在本研究中，B. bruxellensis的单细胞异质性被用作探索其富马酸耐受性机制的工具。通过荧光染色（如DHE）和细胞分选技术，研究者能够区分出具有高ROS水平和低ROS水平的细胞亚群，并进一步分析它们在富马酸存在时的生长表现。

结果表明，高ROS水平的细胞亚群在富马酸存在时表现出更强的生长能力，而低ROS水平的细胞则更容易受到抑制。这提示，ROS水平的差异可能与细胞对富马酸的耐受性直接相关。高ROS水平的细胞可能已经通过呼吸代谢激活了其抗氧化系统，使其能够更有效地应对富马酸诱导的氧化应激。而低ROS水平的细胞则可能缺乏这种适应能力，导致其在富马酸存在时更容易受到抑制。

此外，研究还发现，当NAC被添加到富马酸存在的情况下，高ROS水平的细胞亚群对富马酸的敏感性显著增加。这一结果进一步支持了ROS在B. bruxellensis富马酸耐受性中的作用。NAC作为一种抗氧化剂，能够降低细胞内的ROS水平，从而削弱其对富马酸的耐受能力。这表明，ROS水平的调控可能在该酵母菌株的富马酸耐受性中起到关键作用。

### 低糖饮料中的其他因素

除了富马酸和人工甜味剂，低糖饮料中还可能含有其他成分，如碳酸、维生素、矿物质和pH调节剂。这些成分可能对B. bruxellensis的生长和代谢产生影响。例如，碳酸可能通过改变细胞膜的渗透性或影响细胞内的氧化还原状态，从而影响其对富马酸的耐受性。此外，pH调节剂可能通过改变细胞内的酸碱平衡，进而影响其代谢活性和生存能力。

在实验中，B. bruxellensis被测试在不同pH条件下的生长表现。结果表明，该酵母菌株在酸性环境中仍能良好生长，这可能与其对富马酸的耐受性有关。富马酸本身具有酸性特性，因此，B. bruxellensis可能已经适应了酸性环境，并能够通过调整其代谢通路来应对富马酸的抑制作用。

### 未来研究方向与实际应用

尽管本研究揭示了B. bruxellensis在低糖饮料中的生长潜力和富马酸耐受性，但仍有许多问题需要进一步探索。例如，该酵母菌株在复杂饮料配方中的具体营养利用途径、其在不同环境条件下的代谢适应性，以及其与其他腐败菌（如Z. parabailii）之间的相互作用等。

此外，研究还发现，B. bruxellensis的单细胞异质性可能为其在低糖饮料中的生存提供了优势。这种异质性可能使其能够在不同的环境条件下保持一定的生存能力，从而增加其在工业环境中的传播风险。因此，未来的研究应关注如何通过控制环境条件（如氧气供应、营养成分和防腐剂浓度）来降低B. bruxellensis在低糖饮料中的生长和传播风险。

在实际应用中，本研究的发现可能对饮料行业提出新的挑战。由于B. bruxellensis能够在低糖饮料中良好生长，并且对富马酸表现出较强的耐受性，因此，传统的防腐策略可能需要进行调整。例如，通过减少氧气供应或提高富马酸的浓度，可能能够有效抑制该酵母菌株的生长。然而，这些策略需要在实际生产中进行验证，并确保不会对饮料的口感、色泽或营养价值产生负面影响。

### 结论

本研究揭示了Brettanomyces bruxellensis在低糖饮料中的生长潜力和富马酸耐受性，表明该酵母菌株可能成为低糖饮料腐败的新隐患。其主要依赖呼吸代谢的特性，使其在低糖环境中仍能维持一定的生长速率，而其对富马酸的耐受性则可能与其细胞内ROS水平的异质性有关。高ROS水平的细胞亚群表现出更强的富马酸耐受性，而低ROS水平的细胞则更容易受到抑制。这一发现为饮料行业提供了新的视角，提示在设计低糖饮料的防腐策略时，需要考虑酵母菌株的生理特性及其对富马酸的反应机制。

此外，研究还强调了单细胞异质性在微生物适应性中的重要性。这种异质性可能使B. bruxellensis在不同环境条件下保持一定的生存能力，从而增加其在低糖饮料中的传播风险。因此，未来的研究应进一步探讨该酵母菌株在复杂饮料配方中的适应机制，并开发更有效的控制策略。通过结合单细胞分析、代谢调控和环境干预等手段，可能能够有效降低B. bruxellensis在低糖饮料中的生长和腐败风险，从而保障消费者的健康和产品的质量。