新型水蛭素变体rHMg的规模化生产与功能特性研究——一种优于比伐卢定的高效抗凝剂

本研究发现源自亚洲水蛭的新型重组水蛭素变体rHMg，通过原核表达系统实现高效生产，其抗凝血酶活性达9573 ATU/mg，抑制常数Ki（0.323 nM）和半抑制浓度IC50（2.8 nM）均显著优于FDA批准药物比伐卢定（p<0.001），为心血管疾病抗凝治疗提供了更具成本效益的新策略。

　　

引言

血栓栓塞是缺血性心脏病、缺血性卒中和静脉血栓栓塞等主要心血管疾病发生和发展的关键病理因素。在凝血级联反应中，凝血酶通过连接内在和外在途径发挥关键催化作用，这使其成为驱动血栓形成的主要酶因子和抗凝治疗的核心靶点。

传统抗凝剂虽然仍在临床广泛使用，但存在明显局限性，包括出血风险增加、耐药性出现以及需要定期治疗监测。此外，基于肝素的间接凝血酶抑制剂需要与抗凝血酶相互作用才能实现有效抗凝，这表明其抗凝活性不仅取决于自身浓度，还依赖于抗凝血酶的存在。相比之下，水蛭素通过特异性结合直接有效抑制凝血酶的催化功能，不需要依赖抗凝血酶水平或补充抗凝血酶注射，这种机制在降低出血风险的同时提供卓越的抗凝效果。

水蛭素是一种由64-66个氨基酸残基组成的多肽，分子量约7000 Da，最初从欧洲医用水蛭中分离得到。作为有效的天然凝血酶抑制剂，水蛭素具有多种有益生物活性，包括抗凝和抗血栓形成、抗动脉粥样硬化、抗血管生成和抗肿瘤作用以及抗纤维化作用，显示出广阔的临床应用前景。

水蛭素的抗凝优势源于其独特的三维结构。N端结构域通过三个二硫键形成刚性球状构象，精确占据凝血酶的催化三联体；C端的酸性结构域与凝血酶的Exosite I结合，诱导纤维蛋白原识别的竞争性抑制。这种双靶点抑制机制有效抑制纤维蛋白原向纤维蛋白的转化，并破坏凝血酶介导的血小板活化正反馈循环。

虽然天然水蛭素具有显著药理优势，但其大规模工业生产面临重大挑战。传统提取方法受到水蛭资源稀缺、纯化程序复杂和产量不足的限制。基因工程进步通过序列优化促进了重组水蛭素的合成，在保持生物活性的同时提高了生产效率和批次一致性。多种工程化水蛭素衍生物，如来匹卢定、比伐卢定和地西卢定，已获得FDA批准用于抗凝治疗。

材料与方法

生物信息学分析：从NCBI BLAST数据库检索同源水蛭素序列，使用MEGA 7.0软件进行多序列比对，通过邻接法构建系统发育树。

pET-HMg原核表达载体构建：根据HMg基因序列和pET载体多克隆位点设计含Nde I和Xho I限制酶切位点的引物，通过PCR扩增HMg基因，酶切后连接至pET载体，转化至大肠杆菌Top10感受态细胞，通过菌落PCR和测序筛选阳性克隆。

rHMg的表达、纯化和检测：将pET-HMg质粒转化至大肠杆菌BL21，在LB培养基中37°C培养至OD₆₀₀达1.0-1.2，用1 mM IPTG在18°C诱导24小时。细胞通过离心收获，重悬于PBS中，通过超声破碎裂解。使用Ni-NTA亲和色谱纯化重组HMg，用含20 mM、200 mM和500 mM咪唑的PBS缓冲液进行梯度洗脱。各阶段蛋白样品通过SDS-PAGE分析，纯化蛋白进行变性质谱验证分子量和纯度。

rHMg活性凝血酶滴定测定：将水蛭素样品用PBS稀释至0.0039 mg/mL，凝血酶稀释至40 U/mL，纤维蛋白原溶解至5 mg/mL。在瓷板孔中将200 μL纤维蛋白原溶液与100 μL样品溶液混合，37°C预孵育5分钟，以5 μL/min速率滴定凝血酶溶液，通过肉眼观察纤维蛋白丝形成确定凝血终点。

粘弹性止血测定：使用世纪亿康凝血仪评估水蛭素对全血的抗凝效果。将400 μL全血与100 μL水蛭素在37°C孵育5分钟，加入20 μL 0.25 M CaCl₂并颠倒10次激活凝血，立即将360 μL处理血液加载到测试杯中进行分析。

APTT/PT/TT测定和EC₅₀确定：将重组HMg系列稀释后与血浆按1:4比例混合，PBS作为阴性对照。APTT测定将100 μL样品与100 μL APTT试剂混合，37°C孵育5分钟后加入100 μL预热的0.025 M CaCl₂记录凝固时间。PT测定将100 μL样品37°C孵育5分钟后加入200 μL PT试剂测定凝固时间。TT测定将200 μL样品37°C孵育5分钟后加入200 μL TT试剂测定凝固时间。

显色底物测定凝血酶抑制（K_i和IC₅₀）：将底物S2238在Tris-HCl缓冲液中稀释，比伐卢定和rHMg分别稀释至不同浓度。反应混合物含10 μL凝血酶和10 μL抑制剂，37°C预孵育10分钟，加入180 μL S2238启动反应，监测405 nm吸光度。

结果

序列比对和系统发育分析：BLAST分析显示HMg氨基酸序列与来自多种水蛭的20个同源序列高度同源。多序列比对显示高度序列保守性，黑色阴影表示严格保守残基，灰色阴影表示中度保守区域。邻接法系统发育分析表明HMg与来自H. manillensis的Hirullin-P18聚类最接近，序列相似性达90.62%。

rHMg蛋白的表达和纯化：测序证实成功构建重组质粒pET-HMg，编码74个氨基酸的多肽，理论分子量约8 kDa。SDS-PAGE分析显示诱导和纯化后存在主要蛋白条带（8-13 kDa）。变性质谱精确鉴定融合蛋白为8042.31 Da，与理论预测一致。

rHMg抗凝活性的初步鉴定：使用瓷板凝血酶滴定法评估rHMg的抗凝活性，计算显示rHMg的抗凝血酶活性为9573±296.1 ATU/mg。粘弹性凝血分析表明rHMg以剂量依赖性方式显著延长全血ACT，降低CR并抑制PF。

重组HMg对APTT、PT和TT的延长作用：rHMg显著延长血浆APTT、PT和TT，半最大有效浓度EC₅₀分别为79.25±7.00 nM、1048±176.70 nM和0.09±0.12 nM。TT对rHMg抑制最敏感，其次是APTT和PT。

抑制常数（K_i）和半抑制浓度（IC₅₀）：比较分析显示rHMg的凝血酶结合能力和抑制效果优于比伐卢定。rHMg的抑制常数K_i为0.323±0.144 nM，比比伐卢定低542倍。rHMg的IC₅₀为2.8±0.03 nM，比比伐卢定低135倍。

讨论

天然水蛭素的有限来源、复杂提取方案和低产量严重限制其大规模临床应用，这些限制使重组基因工程成为水蛭素生产的主要策略。虽然大肠杆菌和酵母等表达系统已成功用于重组水蛭素制备，但原核表达面临包涵体形成和缺乏关键翻译后修饰（如酪氨酸硫酸化）等挑战。研究表明，天然水蛭素C端Tyr63硫酸化对于通过静电相互作用与碱性残基锚定凝血酶的Exosite I形成稳定盐桥至关重要，但原核系统无法实现这一修饰。

本研究的多次序列比对和系统发育分析显示，水蛭素HMg与来自Hirudinaria manillensis的Hirullin-P18具有93.55%序列同一性，活性中心关键残基严格保守。虽然重组HMg缺乏Tyr63硫酸化，但其C端阴离子簇通过电荷补偿有效锚定凝血酶Exosite I的碱性口袋，从而减轻了缺乏硫酸化引起的功能缺陷。

本研究成功在大肠杆菌BL21中使用原核表达系统表达了rHMg。通过低温诱导和延长诱导时间至24小时增加了可溶性表达。纯化方法简单，从1 L培养基中获得约36 mg高纯度rHMg。凝血酶滴定测定显示rHMg活性为9573 ATU/mg，相当于每毫升培养基345 ATU，其活性在已报道的原核表达重组水蛭素中排名较高。

重组水蛭素HMg用于全血抗凝，血栓弹力图评估显示其以剂量依赖性方式延长ACT。用2500 nM rHMg时，ACT从基线135 s延长至781 s，显著超过临床阈值。凝血试验显示rHMg最显著延长TT，EC₅₀为0.09 nM，还延长APTT和PT。其抗凝效果优于大多数已报道的天然和重组水蛭素。机制上，rHMg通过两种途径发挥抗凝作用：直接抑制凝血酶活性，阻断纤维蛋白原向纤维蛋白转化；干扰凝血酶介导的内在途径正反馈。

比伐卢定作为FDA批准的直接凝血酶抑制剂，分子量2180 Da，用于经皮冠状动脉介入治疗，面临半衰期短和需要连续静脉输注等临床限制。我们的动力学分析显示，在相同实验条件下，rHMg的抑制常数K_i比比伐卢定低542倍，半抑制浓度IC₅₀显示比比伐卢定好135倍的性能。数据表明其性能优于先前报道的重组水蛭素。

结论

虽然水蛭素面临体内稳定性差、易受蛋白酶影响、生物利用度低、免疫原性和天然来源有限等挑战，但这些问题可以通过蛋白质工程、药物递送系统开发和表达优化来解决。本研究建立了原核表达系统，用于高效生产不需要翻译后修饰的重组水蛭素rHMg，比活性达9573 ATU/mg，显示出比许多报道的重组变体显著的性能优势，比临床药物比伐卢定活性高134倍。作为目前最有效的直接凝血酶抑制剂，水蛭素在心血管疾病管理、体外循环抗凝和血液保存方面具有巨大潜力。开发的rHMg具有高活性、低成本和简化生产工艺等优点，为下一代抗血栓药物的临床转化提供了新的候选分子，推进了抗凝治疗的发展。