HIV-1 Gag蛋白N端结构无序性与病毒颗粒形成的正相关性研究

本研究发现HIV-1 Gag蛋白基质结构域（MA）第9位氨基酸残基（MA-9）通过调控N端区域结构无序性（disorder）动态影响病毒颗粒组装效率。通过分子动力学模拟（MD）、核磁共振（NMR）和定点突变等技术，揭示了MA-9残基类型与Gag二聚化、豆蔻酰化（myristoylation）及Env蛋白包埋的分子机制，为艾滋病病毒（HIV-1）生存策略提供了新见解。

　　

分子建模与HIV-1 Gag前体蛋白的结构特征

HIV-1 Gag前体蛋白是一种多功能结构蛋白，在病毒复制的晚期阶段发挥核心作用。该蛋白包含四个主要结构域：基质（MA）、衣壳（CA）、核衣壳（NC）和p6，各域之间通过无序连接区相连。研究通过分子动力学模拟（MD）构建了全长Gag单体模型，发现该蛋白在溶液中呈现高度柔性构象。根均方偏差（RMSD）分析表明，Gag单体在100纳秒后达到相对稳定的波动状态，其中C端区域（含NC-SP2）是引起持续波动的关键因素。模拟结果显示Gag蛋白在水中折叠成更紧凑的构象，MA结构域弯曲至CA结构域附近，而SP1、NC、SP2和p6结构域紧密聚集。水分可及表面积在所有Gag结构域中均减少，N端到C端距离缩短，这些数据为Gag单体在水溶液中的折叠压缩提供了定量证据。特别值得注意的是，Gag蛋白在MD模拟过程中折叠使得已知的Gag相互作用表面（如CA-SP1和CA NTD用于Gag晶格组装、锌指结构域用于基因组RNA包装、p6 PTAP用于病毒出芽）倾向于更少暴露，提示未结合配体的Gag初始构象可能在决定相互作用顺序中发挥作用。

HIV-1 Gag二聚体的分子建模与结构特征

Gag-Gag相互作用是病毒颗粒形成的起点之一。研究构建了Gag二聚体模型并进行MD模拟，发现二聚体的RMSD在模拟开始后增加，并在200纳秒后达到近平台期。与Gag单体不同，二聚体的水可及表面积在MD模拟期间没有减少，表明在Gag二聚化过程中没有发生显著的分子压缩。同时，相邻单体之间迅速形成5-10个氢键并在1000纳秒的MD模拟中持续维持。研究发现三个疏水区域可能通过疏水相互作用促进二聚体形成，这些界面包括已知的Gag-Gag相互作用关键区域，如两个CA结构域之间的螺旋-螺旋相互作用以及SP1-NC区域之间的相互作用。特别值得注意的是，全长Gag二聚体模型揭示了一个先前未描述的相互作用：MA和CA结构域之间的吸引相互作用。MA N端无序区域的丝氨酸9（MA-S9）与CA的谷氨酰胺287（CA-Q287）在MD模拟中反复形成氢键，出现频率为20.19%。当丝氨酸9被苯丙氨酸取代时，该氢键在MD模拟中消失，表明MA9残基在相邻两个Gag单体的空间接近中发挥作用。该氢键形成的位置不会因Gag MA结构域甘氨酸2上的豆蔻酰基团而产生空间位阻。

Gag MA结构域第9位氨基酸残基的变异分析

MA-S9介导的Gag二聚化相互作用的独特之处在于它涉及MA N端无序区域的氨基酸，而迄今为止报道的Gag二聚化相互作用都发生在结构化螺旋的残基中。为阐明MA-9残基在体内的变异性，研究使用公共HIV序列数据库计算了MA N端（1-10位）各个残基的香农熵。结果显示，Gag-MA N端区域的氨基酸残基通常高度保守，但在第7和第9位观察到一些变异。在20种氨基酸残基中，丝氨酸在MA-9残基中最为丰富，约占Gag序列的69%；精氨酸次之，约占24%；苏氨酸和赖氨酸作为次要种群，各占几个百分点。数据库中含有其他氨基酸残基在第9位的Gag序列数量可忽略不计，表明在人类群体中诱导了严重的HIV-1维持缺陷。特别值得注意的是，在MA-9具有疏水氨基酸残基的变体在序列数据库中很少检测到，表明在人类群体中存在强大的选择劣势。这些结果表明MA-9残基是可变的，但疏水氨基酸替换在进化上是不适应的。

MA-9单点替换对MA N端区域无序潜能的预测影响

蛋白质的内在无序片段通常包含不足比例的疏水氨基酸以防止肽段折叠。因此，MA-9残基的疏水氨基酸替换（在HIV-1序列数据库中很少检测到）可能影响Gag单体MA N端区域的非结构化状态潜力。研究通过AIUPred评估了MA-9单氨基酸替换对Gag MA N端无序状态的影响。预测结果显示，前九个氨基酸的无序评分接近0.5，高于MA-9残基下游区域的评分，这与之前的NMR分析结果一致。值得注意的是，MA-9的芳香族替换（S9F、S9Y和S9W）都导致MA N端区域无序评分的急剧下降。类似地，疏水氨基酸替换通常降低MA N端的无序状态。相比之下，亲水氨基酸替换（包括酸性/碱性氨基酸替换）对无序评分的变化较轻微；除半胱氨酸替换外，这些评分与野生型相似。氨基酸类型依赖的无序谱变化在另一种无序区域预测器PONDR中得到重现。这些数据表明，当MA-9残基发生疏水氨基酸替换时，Gag蛋白的N端变得比野生型更结构化。

Gag-MA和Gag-MA-S9F N端区域的动态特性

溶液中的蛋白质结构动力学在分子相互作用中起关键作用。研究使用NMR检查了MA-9在调节MA结构域N端区域动态特性中的潜在作用。通过比较野生型和MA-S9F突变体的二维¹H–¹⁵N HSQC谱图，发现许多残基的信号在S9F突变后没有变化，表明该突变体具有与野生型相似（如果不完全相同）的结构。然而，残基S6、G10、G11、E12、L13、D14、K15、W16、I19、L21、E52、E55、L85、C87、H89、R91和V94显示出一些化学位移变化。将这些受影响的残基映射到先前报道的Gag MA结构上，发现G10、G11、E12、L13、D14、K15、W16、I19和L21位于螺旋I（S9–E17）内。考虑到野生型中的S9形成螺旋I的N端帽，S9F替换可能扰动了螺旋I的构象。此外，残基E52、E55、L85、C87、H89、R91和V94在三维空间中与S9接近，表明S9F突变也可能影响螺旋V C端区域的构象。通过测定主链¹H-¹⁵N异核NOE值，发现Gag-MA在α螺旋区域的NOE值约为0.8，表明这些α螺旋具有结构刚性；连接这些α螺旋的区域NOE值在0.6至0.8之间，表明这些区域存在快速内部运动；N和C端区域的NOE值低于0.6，表明这些区域存在无序。比较Gag-MA和Gag-MA-S9F之间N端残基A3–L8的NOE值，发现残基A3、A5、S6和L8的NOE值在Gag-MA-S9F中比在Gag-MA中更大，表明无序N端区域的内部运动在S9F替换后受到一定程度抑制。研究人员推测，无序N端区域的运动抑制是F9庞大体积的结果，可能导致涉及F9和分子表面上疏水残基的疏水相互作用。

芳香族和疏水性氨基酸替换Gag-MA-S9显著降低病毒颗粒产生

为研究MA-9残基在HIV-1生命周期中的生物学作用，研究使用HIV-1 NL4-3前病毒克隆进行了定点诱变。根据氨基酸在HIV序列数据库中的频率和化学性质，选择了Gag-MA第9位（S9R/P/G/H/A/E/I/L/Y/F/W）的突变。考虑到Gag-MA S9残基可能对Gag二聚化很重要，预计该位点的突变会影响病毒颗粒的产生。两个已知的病毒生产缺陷型突变体克隆被生成并用作对照：一个是缺乏Gag质膜靶向活性的Gag-MA-G2A突变体克隆（Gag N端豆蔻酰化位点缺陷），另一个是缺乏Gag二聚化能力的Gag-CA-WM184/185AA（WMAA）突变体克隆。通过测量转染HEK293T细胞上清中的Gag-p24水平监测病毒颗粒生产，并通过测量感染TZM-bl细胞中的荧光素酶活性评估病毒感染性。正如预期，对照突变体（Gag-MA-G2A和Gag-CA-WMAA）与野生型NL4-3相比，病毒颗粒生产和病毒感染性均显著降低。值得注意的是，大多数第9位的氨基酸替换以氨基酸残基类型依赖的方式影响病毒产生病毒颗粒和/或感染性病毒颗粒的能力。在测试的S9突变体中，第9位芳香族替换（Gag-MA-S9Y/F/W）的效果显著，病毒颗粒生产和病毒感染性均显著降低至与对照突变体相当的水平。相比之下，S9R替换的效果相对温和，Gag-MA-S9R突变体的病毒颗粒生产和病毒感染性水平与野生型相当。有趣的是，S9T和S9P突变体保留了与野生型相似的病毒颗粒生产能力，但病毒感染性显著降低至NL4-3的20%左右。这些结果与这些突变体在野外观察到的差异频率基本一致，表明MA-9残基在病毒生命周期和生存中起关键作用。

HIV-1 Gag MA结构域N端无序水平与病毒颗粒生产水平正相关的鉴定

研究进一步检查了病毒颗粒生产水平与Gag MA N端无序水平之间的关系。通过计算Gag MA N端前九个氨基酸残基（形成螺旋I上游的N端非结构化帽）的平均无序评分，并检查该评分与相对病毒颗粒生产之间的关系，发现这些结构和生物学值呈正相关，且当使用两种不同的无序状态预测器计算无序评分时具有良好的重现性。当用前20和30个氨基酸残基计算平均无序评分时，这种正相关也是可重现的。这些结果表明Gag N端的无序状态在HIV-1颗粒的最佳生产中起关键作用。当病毒感染性用于相关性分析的对应该部分时，这种正相关性不太明显。研究发现特定氨基酸残基在MA-9位点的检测频率与Gag MA N端无序之间没有相关性，表明在确定HIV-1体内适应度时还涉及其他因素。

Gag-MA-S9T/P突变阻止Env蛋白融入病毒颗粒

研究接下来检查了MA-9位点单点替换损害感染性病毒颗粒生产的分子机制。S9T和S9P突变体表现出超过野生型60%的后代病毒颗粒生产，但产生的病毒颗粒的感染性显著受损至野生型的20%以下。为深入了解这些发现的机制，研究检查了Gag-MA-S9T/P克隆感染性降低是否与它们将Env蛋白融入病毒颗粒有关。通过Western blotting分析发现，Gag-MA-S9T/P的Env融入病毒颗粒降低至NL4-3的30%左右。在Gag-MA-S9R/A/I/G/E突变体中没有观察到这种显著降低，这些突变体保持了相对于NL4-3超过70%的Env融入水平。测试的Gag-MA突变体中的Env融入病毒颗粒与其感染性良好相关。这些结果表明Gag-MA-S9T/P突变可能通过损害Env融入病毒颗粒而降低病毒感染性。HIV-1 Env融入病毒颗粒假定发生在质膜中Gag晶格形成期间或之后。MA-S9位于Gag晶格中两个MA三聚体的界面处，一个MA单体上的MA-S9残基通过与相邻MA单体上的丝氨酸6、丝氨酸9和谷氨酸52形成氢键而相互作用，这意味着MA-9残基可能参与Gag自组装过程中的分子间相互作用。这些结果表明MA-S9可能参与调节Gag与Env或其他反式作用因子之间的相互作用，以实现Env融入病毒颗粒。

显著降低病毒颗粒生产的Gag-MA突变损害Gag寡聚化能力

由于某些Gag-MA-S9突变 drastically 降低了病毒颗粒生产水平，研究接下来通过EGS交联方法检查了Gag-MA-S9突变（R/P/H/A/E/I/W/F）对细胞中Gag寡聚化的影响。对于PBS处理（无EGS），所有测试克隆主要观察到Gag单体（Gag₁）蛋白以及少量Gag-Pol蛋白。对于EGS交联样品，野生型NL4-3ΔPro/ΔEnv产生Gag二聚体（Gag₂）、Gag三聚体（Gag₃）、Gag四聚体（Gag₄）和寡聚化Gag（Gag_5~）产物。正如预期，对于Gag-CA-WMAA克隆，主要观察到Gag单体，未检测到寡聚化Gag（Gag₂~Gag_5~）。对于Gag-MA-G2A克隆，Gag二聚体蛋白的产生相对于野生型显著减少，并且没有观察到大于Gag二聚体的寡聚化Gag产物。六个Gag-MA-S9突变体ΔPro/ΔEnv克隆（S9R/P/H/A/E/I）以与野生型相似的方式表达Gag二聚体（Gag₂）、Gag三聚体（Gag₃）、Gag四聚体（Gag₄）和寡聚化Gag（Gag_5~）产物，尽管这些产物的条带强度不同。重要的是，病毒生产能力 drastically 降低的GA-MA-S9F/W克隆表现出与Gag-MA-G2A相似的表型：虽然所有测试的Gag-MA-S9突变体都观察到Gag二聚体产物减少，但GA-MA-S9F/W克隆的Gag寡聚化（Gag₃~Gag_5~）基本上没有进行超过Gag二聚体形成，这与Gag-MA-G2A的情况相同。这些结果表明MA-G2A和MA-S9F/W突变对病毒生产的抑制源于Gag寡聚化缺陷。这一可能性得到另一种使用纳米生物发光共振能量转移（NanoBRET）系统直接测量活细胞中Gag-Gag相互作用效率的 assay 结果的支持。在该 assay 中，MA-S9F/W突变体显示出比其他MA-9突变体更大的NanoBRET信号产生减少，尽管损伤不如MA-G2A和MA-WMAA突变体明显。与交联实验结果一致，表现出相对严重后代病毒生产缺陷的S9I突变体在NanoBRET信号产生上仅显示中等效果。与病毒生产结果和交联实验结果一致，S9A突变对NanoBRET信号的影响比在MA-S9F和MA-S9W突变体中观察到的 effects 要轻得多。

病毒生产缺陷型Gag-MA突变体显示Gag蛋白膜定位急剧减少

HIV-1 Gag蛋白在病毒组装期间在质膜（PM）处多聚化。为研究病毒颗粒生产和Gag寡聚化能力降低的Gag-MA突变体的Gag膜靶向，进行了膜浮选 assays。HeLa细胞转染前病毒ΔPro/ΔEnv克隆后的裂解物制备并补充高浓度蔗糖，然后在超速离心管上覆盖较低浓度蔗糖。在该 assay 中，膜成分在超速离心后浮在蔗糖层的顶部。从顶部（膜组分：MF）到底部（非膜组分：non-MF）部分分离的Gag蛋白通过Western blotting分析进行监测。对于NL4-3 ΔPro/ΔEnv克隆，Gag蛋白主要在MF中检测到。相比之下，对照Gag-MA-G2A克隆的Gag蛋白在MF中边缘检测到，但主要在non-MF中观察到。在测试的Gag-MA-S9突变体中，Gag-MA-S9I/A克隆表现出Gag蛋白的膜靶向，尽管水平低于野生型中的相应活性。虽然野生型克隆在MF中检测到高比例的Gag蛋白（MF/MF + non-MF比率：约70%），但Gag-MA-S9I和S9A突变体显示的MF/MF + non-MF比率分别约为40%和50%。S9A突变体的结果与之前的研究一致。对于Gag-MA-S9F/W突变体克隆，MF中Gag蛋白的水平相对于non-MF非常低。值得注意的是，Gag-MA-S9F克隆显示non-MF中Gag蛋白与总Gag蛋白的比率约为80%，与Gag-MA-G2A克隆的比率相似。测试的Gag-MA突变体中的Gag定位似乎与它们的病毒颗粒生产相关。这些结果表明，Gag的膜靶向受到Gag-MA-S9突变（尤其是S9F/W）的显著损害，并且Gag膜靶向的缺陷与病毒颗粒生产的显著减少良好相关。

Gag-MA-S9突变影响Gag蛋白的N端豆蔻酰化

病毒颗粒生产和Gag寡聚化缺陷的Gag-MA突变体显示膜靶向Gag蛋白水平显著降低。Gag-MA G2残基的N端豆蔻酰化是Gag蛋白PM靶向的先决条件。据报道，N端八肽氨基酸序列（G-X-X-X-S/T-X-X-X-，X为任何氨基酸）对N端豆蔻酰化反应很重要。研究因此检查了Gag-MA-S9突变是否影响Gag蛋白的N端豆蔻酰化。前病毒ΔPro/ΔEnv克隆转染HEK293T细胞，通过Click-iT反应将转染细胞中的任何豆蔻酰化蛋白生物素化，然后使用链霉亲和素进行Western blot分析以可视化豆蔻酰化蛋白。结果显示，NL4-3容易检测到N端豆蔻酰化Gag蛋白，而Gag-MA-G2A突变体未观察到N端豆蔻酰化Gag蛋白。对于Gag-MA-S9I/A突变体克隆，N端豆蔻酰化Gag蛋白适度减少 compared to their levels in the野生型。有趣的是，Gag-MA-S9F/W突变体克隆产生 barely 可检测水平的N端豆蔻酰化Gag蛋白。这些结果表明，Gag的N端豆蔻酰化受到Gag-MA第9位某些突变的强烈抑制。这种豆蔻酰化Gag蛋白的减少可以解释Gag-MA-S9F/W突变体中Gag膜靶向和随后病毒颗粒生产的 drastically 减少。总之，病毒学研究表明，MA-9残基的疏水氨基酸替换损害了细胞中后代病毒颗粒形成的基本和整体过程。

讨论

本研究从结构角度重新审视了HIV-1 Gag N端区域的作用。通过计算机和实验方法，获得了证据表明HIV-1 Gag MA-9残基参与HIV-1体内适应度，并具有调节Gag N端肽段无序水平和运动动力学的能力。研究进一步证明MA-9残基能够调节HIV-1后代颗粒形成的效率。最后，研究发现病毒颗粒形成水平与N端无序水平呈正相关。据所知，这是首次显示MA-9残基结构作用与Gag N端无序肽段生物学作用并行的工作。

研究为HIV-1 Gag N端区域结构的调控提供了新见解。首先，它提供证据表明MA-9位点的单疏水氨基酸替换足以降低MA N端区域的无序潜力。这一发现与蛋白质折叠原理一致，即蛋白质的内在无序片段包含不足比例的疏水氨基酸以防止折叠。其次，NMR研究揭示MA-9位点的单疏水替换足以诱导MA N端片段运动动力学的减少和MA结构域的构象变化。这些发现披露，在MA-9位点保留非疏水残基是维持Gag N端片段高水平结构无序和动力学的先决条件。

研究还提供了关于MA-9残基生物学重要性的新见解。MA-9残基位于Gag MA N端区域的N端豆蔻酰转移酶识别片段（G-X-X-X-S/T） immediately 下游。先前研究表明MA-9残基参与生物学过程，如Gag前体的质膜靶向、病毒释放和与靶细胞膜的病毒融合。生物学数据与先前发现以及结构数据一致。由于分子相互作用取决于相互作用区域的结构和动力学，MA N端区域和MA构象的无序状态和运动动力学的变化可能影响Gag翻译早期事件，如Gag单体与N端豆蔻酰转移酶的相互作用。这反过来可能影响随后涉及MA结构域的病毒颗粒形成事件，如Gag蛋白与tRNA结合以实现Gag靶向质膜、质膜中Gag-Gag相互作用以实现Gag寡聚化以及Env融入病毒颗粒。

此外，全面诱变揭示了先前研究中未披露的突变效应氨基酸依赖性：所有测试的单疏水氨基酸替换都损害HIV-1颗粒形成，尽管不同突变之间的损害程度不同。与这些发现一致，疏水氨基酸在MA-9位点在公共HIV-1序列数据库中很少检测到。这些发现表明，在MA-9位点保留非疏水残基是优化细胞中病毒颗粒形成和HIV-1体内适应度的先决条件。

最后，研究为保留Gag N端区域非结构化状态的重要性提供了新颖见解。研究发现病毒颗粒生产水平与Gag N端片段无序潜力水平呈正相关。这意味着保留Gag N端片段的高水平无序对于病毒颗粒的最佳生产至关重要。蛋白质末端的无序区域的这种生理意义也在人UDP-α-D-葡萄糖-6-脱氢酶中报道，其中C端无序片段在控制酶结构动力学以利于抑制剂结合中起关键作用。

总之，当前发现阐明了HIV-1生存策略的微观和宏观方面之间的关系。数据表明Gag MA-9残基在维持Gag N端片段的非结构化状态和运动动力学以优化宿主细胞中后代病毒生产方面起关键作用。该模型为HIV-1 Gag前体蛋白N端组分在HIV-1进化历史中持续无序提供了合理解释。