STING通路中BTK-DDX41轴在巨细胞病毒裂解性感染期间的激活机制与免疫逃逸策略

本研究发现，在巨细胞病毒（CMV）裂解性感染过程中，宿主通过BTK-DDX41-STING信号轴启动天然免疫应答，但病毒通过其皮层蛋白pp65/pp71与DDX41相互作用，将其滞留于病毒组装区（vAC）并抑制其酪氨酸磷酸化，从而逃逸免疫监控。研究通过BTK抑制剂奥布替尼（orelabrutinib）验证了该通路的抗病毒功能，为CMV免疫逃逸机制提供了新见解。

　　

INTRODUCTION

人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus, CMV）是一种广泛传播的β-疱疹病毒，在发达国家成人中感染率达40%–60%，在发展中国家血清阳性率接近100%。初次感染后，病毒潜伏于髓系细胞，可在免疫失调或细胞分化条件下重新激活进入裂解复制期。虽然原发感染和再激活在免疫正常个体中常无症状，但对免疫受损、抑制或未成熟个体（如先天性感染婴儿）可能引发严重疾病甚至死亡。早期天然免疫应答在控制CMV感染中至关重要，其通过模式识别受体（PRRs）识别病毒双链DNA（dsDNA）基因组，触发干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISGs）的产生。已知多种DNA传感器如cGAS、IFI16、AIM2和ZBP1参与此过程，但DEAD-box解旋酶41（DDX41）在CMV感染中的作用尚不明确。DDX41是一种细胞内dsDNA传感器，可被布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）激活后通过STING（干扰素基因刺激蛋白，又称MITA或ERIS）信号通路诱导I型IFN产生。本研究旨在探究BTK-DDX41-STING信号轴在CMV裂解感染中的激活机制及病毒逃逸策略。

MATERIALS AND METHODS

研究采用原代人包皮成纤维细胞（NuFF-1）培养体系，使用基于细菌人工染色体（BAC）的重组病毒TB40/E^mCherry（WT）和TB40/E^mCherry-UL99^eGFP（UL99^gfp）进行感染实验。病毒滴度通过50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）测定。蛋白质分析采用RIPA缓冲液裂解细胞，通过Western blot检测BTK、DDX41、STING、TBK1及其磷酸化形式。免疫荧光（IFA）用于观察蛋白质共定位，共聚焦显微镜分析STING与BTK、pBTK-Y551、DDX41和TBK1的亚细胞分布。共免疫沉淀（co-IP）验证STING与BTK、DDX41的相互作用。核质分离实验评估DDX41的转位情况。BTK抑制剂奥布替尼（orelabrutinib）用于功能抑制实验，细胞活力通过CellTiter-Glo法检测。病毒基因组DNA和mRNA分别通过qPCR和RT-qPCR定量。

RESULTS

BTK-DDX41-STING signaling is activated during lytic CMV infection

CMV裂解感染诱导了BTK-DDX41-STING信号轴的激活。感染后6小时（hpi），BTK和DDX41的酪氨酸磷酸化水平显著上升，并持续至96 hpi，与poly(dA:dT)转染的激活模式相似但更持久。总DDX41蛋白水平也随时间增加。STING和TBK1的磷酸化在感染后早期即被检测到，且与干扰素刺激DNA（ISD）转染的阳性对照相当。IFN-β（IFNB）mRNA表达在3 hpi达到峰值并持续上调。免疫荧光显示，感染细胞中BTK、pBTK-Y551、DDX41和TBK1与STING在核周区域共定位，共定位细胞比例在40%–50%之间。Co-IP进一步证实了STING与BTK及DDX41的物理相互作用，支持该信号通路的功能性组装。

CMV redistributes a fraction of DDX41 to the cytoplasm

CMV感染导致部分DDX41从核内转位至细胞质。在未感染细胞中，DDX41主要定位于细胞核；感染后24 hpi起，DDX41逐渐向核周区域迁移，至72–96 hpi时，50%–60%的感染细胞显示胞质DDX41聚集。使用UL99^gfp病毒（标记vAC标志蛋白pp28）证实，部分DDX41定位于病毒组装区（vAC）。核质分离Western blot显示，感染后胞质DDX41比例随时间增加，而核内仍保留部分DDX41。共聚焦显微镜分析显示，DDX41与vAC标志蛋白pp65具有中等程度的共定位（Pearson系数支持），但与病毒DNA复制区标志蛋白UL44无特异性共定位。值得注意的是，胞质DDX41的酪氨酸磷酸化水平显著低于核内DDX41，表明其胞质转位可能导致功能失活。

DDX41 interacts with CMV-encoded tegument proteins

CMV皮层蛋白pp65和pp71与DDX41发生相互作用。免疫荧光显示，DDX41在vAC内与pp65和pp71共定位。Co-IP实验证实DDX41与pp65存在强结合，与pp71结合较弱。这一发现与已知的CMV逃逸机制一致：pp65可抑制cGAS和IFI16的DNA感知功能，pp71则干扰STING-TBK1-IRF复合体组装。本研究首次揭示pp65/pp71与DDX41的相互作用，提示病毒可能通过皮层蛋白捕获并失活DDX41。

Activated BTK-DDX41-dependent STING signaling limits CMV protein expression and replication

通过BTK抑制剂奥布替尼抑制该信号轴可促进CMV复制。奥布替尼处理（0.5 μM）显著降低BTK和DDX41的磷酸化水平及总DDX41蛋白量，并轻微抑制IFNB转录。功能实验显示，抑制剂处理的感染细胞中病毒早期蛋白UL44和晚期蛋白pp65表达增加，病毒基因组拷贝数在72 hpi显著上升，多步生长曲线中细胞游离病毒产量在8–16 dpi升高（12 dpi最显著），细胞相关病毒也有增加趋势。这些结果证明BTK-DDX41-STING信号轴在限制CMV复制中发挥保护作用。

DISCUSSION

本研究揭示了BTK-DDX41-STING信号轴在CMV裂解感染中的双重角色：一方面，宿主通过该通路激活抗病毒应答；另一方面，病毒通过皮层蛋白pp65/pp71与DDX41结合，将其滞留于vAC并抑制其磷酸化，从而逃逸免疫监控。与cGAS和IFI16的已知逃逸机制类似，DDX41的胞质失活是CMV免疫逃逸策略的新组成部分。值得注意的是，尽管部分DDX41被失活，核内及部分胞质DDX41仍保持活性，这解释了奥布替尼抑制后病毒复制增强的现象。未来研究需深入探讨DDX41是否被包装入病毒粒子（类似IFI16），以及其在早期感染中的潜在功能。本研究为CMV与宿主免疫互作提供了新视角，并为靶向BTK-DDX41轴的抗病毒策略奠定基础。