囊性纤维化患儿与动物模型粪便胆汁酸谱分析：揭示宿主与微生物代谢互作新机制

本研究通过全面和聚焦的胆汁酸（BA）谱分析，揭示了囊性纤维化（CF）患儿粪便中特定BA种类及代谢物的显著变化，并发现CF动物模型（小鼠与雪貂）的BA谱与人类存在显著差异。研究结合宏基因组学分析，指出CF相关的BA代谢异常可能源于宿主肠道吸收缺陷与微生物BA代谢途径（如bsh基因家族）改变的共同作用，为理解CF胃肠道病理机制及开发靶向疗法提供了新视角。

　　

ABSTRACT

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种由CFTR基因突变引起的遗传性疾病，其特征包括胆汁酸（Bile Acid, BA）代谢异常。本研究通过全面（n=89）和聚焦（n=21）的BA谱分析，比较了CF患儿（cwCF）与健康儿童的粪便样本，发现cwCF中特定BA种类及代谢物存在显著差异。聚焦分析显示cwCF总BA水平显著升高，且部分BA类别发生改变。匹配的细菌宏基因组分析显示，在此小规模队列中，两组间α多样性无显著变化，但^{Bacteroidetes门相对丰度降低（与既往报道一致）。此外，cwCF中bsh基因家族（细菌合成次级BA的关键限速酶）丰度呈降低趋势。这些结果表明，cwCF的BA代谢异常可能涉及宿主和微生物BA代谢途径的共同缺陷。对雪貂和小鼠CF模型的粪便BA分析显示，其BA谱与人类存在显著差异，且雪貂模型中CF与非CF动物的BA变化趋势与人类相反，提示现有动物模型在BA功能研究中的局限性。本研究为理解CF相关BA代谢紊乱提供了新见解，并强调了CF动物模型在BA研究中的注意事项。}

INTRODUCTION

CF主要由CFTR蛋白功能缺陷引起，导致氯离子和碳酸氢盐分泌异常，引发黏膜表面水合失衡及肺、胆道和肠道黏稠黏液积聚。尽管肺部疾病在成人CF患者中占主导，胃肠道（GI）并发症却是婴幼儿CF患者发病的重要原因，包括胎粪性肠梗阻、小肠细菌过度生长和营养吸收不良等。

早期研究表明，cwCF肠道菌群α多样性降低，且这种生态失调可持续至成年期。CF结肠的生理特征包括过量黏液、脂肪含量升高、酸性pH、炎症、抗生素扰动及BA改变。BA在塑造肠道微生物定植和功能中起关键作用，既可作为去污剂，又支持肠上皮细胞脂肪吸收。肝脏产生初级BA，未被回肠吸收的BA在结肠经微生物修饰，生成非结合BA和次级BA，显著增加肠肝循环中BA的结构和功能多样性。BA具有直接抗菌功能，可通过破坏细菌膜发挥抑菌或杀菌作用，因此BA修饰是微生物的重要防御机制。

CF患者及小鼠模型中均报道粪便BA排泄量增加三倍。健康个体中，次级BA如石胆酸（LCA）和脱氧胆酸（DCA）主导粪便BA谱。既往研究提示，成人CF患者存在BA吸收不良及十二指肠BA中胆酸（CA）与鹅脱氧胆酸（CDCA）比率升高。然而，针对cwCF的BA稳态及其与肠道菌群关系的研究尚不充分，且既往BA分析仅涵盖数百种BA物种中的一小部分。本研究旨在填补这些知识空白，并评估CF动物模型（雪貂和小鼠）在BA研究中的适用性。

RESULTS

CF-related alterations in the fecal bile acid metabolome among children

通过超高效液相色谱质谱（UPLC-MS/MS）分析15名cwCF和15名健康儿童的粪便样本（全面BA面板，89种物种），84种BA被检测到。BA按生物合成来源分为七类：初级结合BA（primary cBA）、初级非结合BA（primary uBA）、次级结合BA（secondary cBA）、次级非结合BA（secondary uBA）、次级代谢物、肝脏解毒产物（如硫酸盐和葡萄糖醛酸结合物）以及合成中间体和 atypical BA。

比较发现，cwCF粪便中源于肝细胞的BA类别（如primary uBA、合成中间体和atypical BA）呈非显著升高，而直接由微生物代谢产生的BA（如secondary uBA和次级代谢物）呈非显著降低。总BA水平无显著差异，但存在升高趋势。线性模型分析显示，仅7 alpha OH 3 oxo 4 cholestenoic acid的调整后P值<0.05。

通过计算平均log2浓度差异，筛选出21种差异最显著的BA物种进行聚焦分析（样本量增至18名cwCF和18名对照）。聚焦分析显示，cwCF中primary uBA及合成中间体和atypical BA显著增加，总BA水平显著升高（与成人CF研究一致）。线性模型校正多重比较后，仅β鼠胆酸（beta muricholic acid）和别胆酸（allocholic acid）存在组间差异。Primary uBA与primary cBA的相关性分析表明，cwCF粪便primary uBA升高可能与肝脏BA合成增加和回肠BA吸收受损共同相关。

Metagenomic analysis of human fecal samples

对15名cwCF和15名对照的粪便样本进行宏基因组测序。α多样性（Shannon指数）无显著差异，但CF样本有降低趋势。 taxonomic分析显示样本CF4为异常值（80%丰度集中于两个门），CF4、CF8和CF14中^{Proteobacteria丰度较高。Bacteroides相对丰度呈降低趋势。}

BA代谢相关基因分析显示，cwCF中^{bsh基因家族丰度有降低趋势（P=0.052），而baiE基因（编码7-α-脱羟酶）呈非显著增加。这些数据提示，cwCF中细菌源性次级BA的减少可能源于bsh介导的去结合步骤受限。同时，CF相关primary uBA的增加若非菌群失调限制社区-wide BA去结合机制，可能更为显著。}

BA物种与菌门相关性分析显示，CF样本中^{Bacteroidetes与primary cBA（如胆酸）呈负相关，且许多BA与低丰度菌门相关，表明微生物群落组成与BA丰度的关系可能还受宿主肠道BA吸收变化的影响。}

Characterizing mouse and ferret BA profiles to assess their utility for studying BA in CF

使用聚焦BA面板分析小鼠和雪貂CF模型的粪便BA。C57BL/6 ^{cftrF508del小鼠与野生型对照无显著差异，仅脱氢石胆酸（dehydrolithocholic acid）存在组间差异。}

雪貂模型中，CF动物显示primary cBA显著增加（与人类似），但其他BA类别及总BA水平均降低（与人类相反）。线性模型校正后，9/23 BA存在显著差异。Bray-Curtis β多样性分析显示，雪貂CF与非CF群体的BA谱差异显著（与人类队列类似），而小鼠无显著差异。非CF人类、小鼠和雪貂的BA谱存在部分重叠，但CF样本中仅人类与雪貂有重叠。总体而言，人类与动物模型的BA谱显著不同。

DISCUSSION

本研究首次对cwCF粪便BA谱进行全面分析，发现总BA水平显著升高且组成存在显著差异。Primary uBA的增加凸显了微生物生态失调对BA代谢的潜在影响，可能与宿主肠道BA吸收变化共同作用。合成中间体和atypical BA的差异可能反映肝脏代谢变化。

宏基因组分析为探索微生物BA代谢提供了可挖掘数据，尽管^{bsh和baiE基因丰度变化未达显著性，但趋势一致。未来研究需结合宏转录组学，评估BA与细菌BA代谢基因表达的关系。}

动物模型分析显示，小鼠BA谱与人类差异显著，因其肝脏利用Cyp2c70酶将CDCA代谢为亲水性鼠胆酸盐（如αMCA、βMCA）。雪貂模型虽显示CF相关BA谱变化，但与人类趋势相反，且缺乏关键次级BA（如DCA和LCA）。这些发现提示，从动物模型推断人类BA代谢需谨慎。

研究局限性包括样本量小、未控制饮食、样本存储条件不一致及BA水平按粪便重量标准化可能受多种因素影响。本研究为理解CF中BA代谢与微生物互作奠定了基础，并为开发^{in vitro}和^{in vivo}模型提供了数据支持。