全球海洋细菌中甲硫氨酸合成与甘氨酸甜菜碱去甲基化的协同机制及其生态意义

本研究发现了一种独特的钴胺素（B12）依赖性甲基转移酶系统（MtgBCD），该系统在需氧海洋细菌中兼具甲硫氨酸（Met）合成和甘氨酸甜菜碱（GBT）去甲基化双重功能。通过多组学分析和遗传验证，揭示了该模块化酶系统在海洋碳氮循环、微生物互作及维生素B12依赖性代谢网络中的核心作用，为理解海洋微生物驱动的地球化学过程提供了分子基础。

　　

Significance

海洋生产力由光养和异养微生物的相互作用驱动。甘氨酸甜菜碱（GBT）作为重要的渗透调节剂、营养源和能源，是影响这些相互作用的关键代谢物。GBT去甲基化是该代谢途径的第一步，但其分子机制尚未明确。本研究识别了GBT去甲基化途径，证明其在全球海洋中广泛存在且高度活跃。我们发现一种多聚体钴胺素依赖性甲基转移酶（最近被鉴定为替代性甲硫氨酸合酶）在GBT去甲基化中具有双重功能。这种模块化酶可通过使全球海洋中的广布性海洋细菌去甲基化多种浮游植物衍生的甲基化合物来增强其生长。

Abstract

在所有生命领域中，钴胺素依赖性甲基转移酶已多样化以执行一系列关键功能，如甲硫氨酸合成和各种还原态氮硫化合物的去甲基化。这些大型模块化酶通常具有三个底物结合结构域（两个结合甲基供体或甲基受体）以及一个钴胺素结合结构域。本研究通过挑战当前GBT分解代谢范式，鉴定出需氧环境细菌中一种独特的甲基转移酶，兼具甲硫氨酸合酶和GBT甲基转移酶功能。以海洋细菌Ruegeria pomeroyi DSS-3为模型，我们证明核心钴胺素结合结构域（MtgC）和双向甲基转移酶（MtgD）对甲硫氨酸合成和GBT去甲基化都至关重要。MtgC在系统发育上不同于经典甲硫氨酸合酶（MetH）或厌氧细菌和古菌中发现的GBT甲基转移酶的钴胺素结合结构域。在全球海洋中，mtgC的表达频率高于先前已知的GBT分解代谢途径，这是因为它存在于丰富的广布性海洋细菌中。因此，我们揭示了自然界中GBT分解代谢与甲硫氨酸合成之间的独特联系，并确定了全球海洋中N-渗透物去甲基化的主要途径。

Results

Proteomics Reveals Growth on Glycine Betaine Requires a Unique Methyltransferase

为识别参与GBT利用的关键蛋白质，我们在以琥珀酸盐（对照）、肉碱、胆碱或GBT作为唯一碳源生长的R. pomeroyi DSS-3细胞上进行了比较蛋白质组学分析。在所有条件下共检测到1750种蛋白质，其中在N-渗透物生长期间，有37（胆碱生长）至69（GBT生长）种蛋白质显示合成增加。这些蛋白质包括与甲基营养相关的蛋白质，如四氢叶酸（H₄F）C₁氧化途径和丝氨酸循环，以及将丝氨酸转化为丙酮酸和铵的L-丝氨酸-氨裂解酶（SdaA）。后者在所有N-渗透物条件中代表了一些差异最显著的合成蛋白质。此外，将肉碱（CdhABC）和胆碱（BetABC）转化为GBT所需的蛋白质、预测的二甲基甘氨酸和肌氨酸（单甲基甘氨酸，MMG）去甲基化步骤以及预测的BCCT型GBT转运蛋白（OpuD）的合成也增加了。

生长在甲基化化合物上的R. pomeroyi DSS-3细胞还合成了几个由单独ORF编码的蛋白质，这些蛋白质与在P. inhibens中鉴定为分裂甲硫氨酸合酶的蛋白质以及编码D. hafniense和M. vulcani中三亚基GBT去甲基酶的蛋白质同源。这些包括一个钴胺素结合蛋白（由SPO2160编码，MtgC）和一个蝶呤结合蛋白（由SPO1863编码，我们称之为MtgD）。MtgD和MtgC与P. inhibens中分裂甲硫氨酸合酶的蝶呤结合亚基（模块1）和钴胺素结合亚基（模块2）同源。甲硫氨酸合酶的同型半胱氨酸结合亚基（模块3）（P. inhibens中的PGA1_c13370），我们称之为MtgE，在R. pomeroyi DSS-3中由SPO1884编码，并且在N-渗透物生长期间丰度略低，这与组成型生产以及在缺乏外源甲硫氨酸的最小培养基中甲硫氨酸合成的关键作用一致。MtgE也与S. meliloti中预测的Bhmt同源。两种含有pfam06253结构域的蛋白质（SPO2108, SPO2134）（已知是D. hafniense和M. vulcani中真正的MtgB，参与GBT去甲基化）的相对丰度也增加了。

与MtgC预测为钴胺素依赖性一致，如同D. hafniense中的GBT去甲基酶，钴胺素合成所需的蛋白质在甲基化合物生长期间相对于琥珀酸盐对照更为丰富。同样，由SPO2041（RamA）和SPO2162（DUF1638）编码的蛋白质（预测在P. inhibens、D. hafniense和M. vulcani中实现钴胺素的还原再充电）在细胞生长于N-渗透物时也更丰富。

MtgC and MtgD Are Essential for Methionine Synthesis and GBT Demethylation

鉴于MtgC与在P. inhibens中对甲硫氨酸合成至关重要的钴胺素结合结构域蛋白（PGA1_c13350）具有高序列同一性，我们假设该蛋白质可能在GBT去甲基化和甲硫氨酸合成中都具有双重作用。为评估SPO2160是否确实编码一种双重功能蛋白质，我们在R. pomeroyi DSS-3中生成了一个敲除突变体（ΔmtgC::Gm）。虽然ΔmtgC::Gm在丰富培养基中的生长未受影响，但在缺乏甲硫氨酸的最小培养基中生长停止，表明该突变体是甲硫氨酸营养缺陷型。类似地，SPO1863（mtgD）缺失也显示出甲硫氨酸营养缺陷型。向最小培养基中添加甲硫氨酸（0.1 mM）恢复了mtgC和mtgD突变体以琥珀酸盐作为唯一碳源的生长。以GBT作为唯一碳源的生长或GBT消耗都不能通过添加甲硫氨酸来挽救，证明mtgC编码分裂MetH和GBT甲基转移酶的核心亚基。mtgD突变体在GBT上的生长也不能通过添加甲硫氨酸恢复，表明MtgD也起双向作用。用质粒编码的天然mtgC互补ΔmtgC::Gm逆转了甲硫氨酸营养缺陷型并恢复了GBT分解代谢，从而恢复了以该底物作为唯一碳源的生长，证实了mtgC的双重功能性。基于这些遗传和蛋白质组学数据，我们提出了一个在需氧环境细菌中GBT去甲基化的模型，该模型与甲硫氨酸合成复杂地联系在一起。

将来自R. pomeroyi DSS-3和P. inhibens的MtgC与所有其他古菌和细菌甲基转移酶的类咕啉结合结构域进行系统发育定位，揭示了一个独特的起源。经典多结构域MetH的钴胺素结合结构域位于所有其他分裂甲基转移酶之外。海洋玫瑰杆菌群中发现的MtgC也不同于厌氧菌D. hafniense中GBT甲基转移酶的钴胺素结合亚基，并且与 Alphaproteobacteria 中发现的氯甲烷甲基转移酶（CmuA）密切相关。

mtgC Is Present in Phylogenetically Diverse Marine Bacteria and Colocated with GBT Metabolism Genes

为更好地理解mtgC在海洋生态系统中的分布，我们筛选了各种远洋海洋细菌的基因组，这些基因组来自培养分离株、单细胞扩增基因组（SAG）或宏基因组组装基因组（MAG）。在系统发育多样化的全球性远洋海洋细菌群中发现了mtgC的同源物，这些细菌与Alpha-、Delta-和Gammaproteobacteria相关，包括SAR116、SAR324和SUP05进化枝。我们接下来仔细检查了600多个海洋细菌基因组，发现约70%（156个中的108个）编码MtgBCD基因的基因组缺乏编码经典MetH的基因。相反，在239个编码metH的基因组中，只有28个编码MtgBCD基因。同时拥有metH和mtgBCD的基因组通常限于Hyphomicrobiales、SAR324簇和某些Alphaproteobacteria属。典型的metE在大多数拥有MtgBCD基因的基因组中缺失。拥有GBT单加氧酶（GbcAB）但不拥有MtgBCDE的Citreicella sp. SE45和其他细菌拥有经典的MetH。这些数据表明，在系统发育不同的海洋细菌中发现的MtgBCD是独立于MetH和产甲烷菌中发现的MtgBCD进化而来的。拥有这种双重功能的甲基转移酶可能也使得随后丢失MetH成为可能，这得到了其在大多数拥有MtgBCD的细菌中缺失的支持，同时也显著拓宽了已知的海洋中对钴胺素的需求。

与R. pomeroyi DSS-3和P. inhibens不同，GBT去甲基化所需的ORF，包括那些钴胺素再活化、甲基的C₁氧化以及随后的去甲基化步骤所需的ORF，经常在基因组上共定位，甚至存在于操纵子中。在S. meliloti中，编码MtgBCDE、两个还原反应模块和钴胺素生物合成操纵子的ORF全部共定位。在全球性海洋Alpha-、Gamma-和Deltaproteobacteria中，编码GBT后续去甲基化步骤的基因通常位于mtgBCD附近，然而，mtgE则不是。Pelagibacteraceae基因组中未编码MtgC同源物，这与存在一个编码Bhmt同源物的基因一致，该同源物与真正的人类Bhmt更相似。SAR11缺乏MetE、MetH和分裂甲硫氨酸合酶（MtgBCDE）。因此，它们依赖外源甲硫氨酸、DMSP或推测为GBT（Bhmt）来进行甲硫氨酸合成。

Genes Encoding MtgBCD Are Highly Expressed in the Global Ocean

鉴于mtgBCDE在多样远洋海洋细菌中的存在，我们使用Ocean Gene Atlas（OGA）门户仔细检查了TARA Oceans数据集。为了比较，确定了预计对GBT去甲基化至关重要的mtgC和SAR11进化枝bhmt的分布、丰度、表达和多样性。与其在海洋细菌中的有限存在一致，gbcAB（GBT单加氧酶）的同源物丰度较低，因此省略了进一步分析。虽然bhmt主要发现于远洋海洋Alphaproteobacteria，主要是Pelagibacteraceae，但只有37%的总mtgC读数分配给Alphaproteobacteria，包括Rhodobacteraceae。相比之下，metH的多样性以Bacteriodota和Cyanobacteria为主，它们也是总metH表达的重要贡献者， alongside Gammaproteobacteria。与bhmt不同，10%的mtgC读数分配给海洋Gammaproteobacteria，包括Candidatus Thioglobus，SUP05进化枝的一个成员。近30%的读数分配给Pseudomonadota门以外的分类群，包括5%归类为Actinomycetota。与其在SAR11进化枝细菌中的存在一致，bhmt在所有海洋采样点的丰度都高于mtgC，除了南大洋，其存在于10%至30%的细菌中。相比之下，mtgC的表达在所有海洋区域等于或高于bhmt，其中mtgC表达最大的区域发生在bhmt最低的区域。metH是三个基因标记物在海洋中丰度最高的，只有在极地地区其转录才低于mtgC，后者的表达在较高纬度地区最为显著。在记录到总mtgC表达最高的站点，与Rhodobacteraceae和Gammaproteobacteria相关的转录本百分比高于总mtgC表达较低的站点。在mtgC表达水平较低的站点，Candidatus Handelsmaniibacteriota、未分类的Alphaproteobacteria和未分类的Pseudomonadota的贡献相对于Rhodobacteraceae和Gammaproteobacteria增加。

为了进一步推断mtgC在海洋细菌中的功能作用，我们还仔细检查了OGA中的mtgB、mtgD和mtgE。所有三个基因的丰度谱在全球海洋中相当，并且与mtgC一致。mtgB和mtgD的基因表达谱通常与mtgC匹配，并且与我们GBT生长的R. pomeroyi DSS-3细胞的蛋白质组学数据相当，其中MtgBCD的合成多于MtgE。这些数据表明GBT去甲基化途径在全球海洋中被激活。

Discussion

GBT是自然界中常见的渗透调节剂，是环境细菌和微藻相关细菌重要的营养和能源。然而，支撑GBT利用的分子标记仍然知之甚少，特别是在海洋生态系统中，损害了我们大规模研究原位循环或特定共培养研究的能力。在这里，我们鉴定了一种与钴胺素依赖性甲基转移酶相关的独特多亚基酶，参与GBT去甲基化和甲硫氨酸生物合成。GBT利用基因的分子表征揭示了mtgBCD在全球性海洋远洋Alpha-、Gamma-和Deltaproteobacteria中的存在，扩大了已知GBT利用者的多样性，并基于DMG和MMG去甲基化的分子标记为其在海水中的GBT消耗 proposed contribution 提供了解释。

甲基化N-渗透物为海洋细菌提供补充能源，可以帮助缩短它们对有机物输入的反应时间，并在饥饿期增加其生存能力。N-渗透物周转产生补充能量导致铵的再矿化，提供了一种促进关键无机营养循环的机制，通过刺激浮游植物生产影响海洋生物地球化学。虽然放射性示踪剂培养研究预测大部分GBT作为渗透调节剂被保留，我们的宏转录组学分析显示参与GBT去甲基化的基因在海洋大部分区域被诱导。因此，这种高水平的mtgBCD转录表明GBT分解代谢可能通过释放铵来介导原位异养-光养相互作用以支持初级生产。

虽然海洋光养生物被认为是海洋GBT的主要来源，但缺乏细菌在共培养期间利用藻类伙伴产生的GBT的直接证据。最近使用转录组学在一个包含Emiliana huxleyi（颗石藻）和P. inhibens（Rhodobacteraceae）的模型系统中研究了真核微藻-细菌相互作用。在这项研究中，在共培养与单培养相比中，鉴定出多个甲基团代谢所需基因的上调。这些基因的同源物与N-渗透物生长的R. pomeroyi细胞中高丰度的基因相匹配。这表明GBT是光养和异养之间代谢交换的关键货币——已知该过程在实验室条件下能稳定光养-异养相互作用。这包括mtgBCD的上调以及相关的钴胺素还原再活化基因、opuD、后续去甲基化步骤的基因以及H₄F连接的C₁氧化基因。

MtgBCD代表了这些模块化酶在需氧细菌中操作进行GBT去甲基化的一个例子。除了MetH，钴胺素依赖性甲基转移酶通常与栖息在缺氧条件下的细菌和古菌有关，其中GBT特异性和季胺特异性钴胺素依赖性甲基转移酶已在厌氧细菌中得到表征。我们的系统发育分析显示，核心亚基MtgC的钴胺素结合结构域并非直接进化自经典MetH，也非革兰氏阳性硫还原细菌或产甲烷古菌中发现的MtgC。因此，先前在P. inhibens中鉴定的分裂甲硫氨酸合酶（其亚基与这里鉴定的非常相似）并非简单地从经典MetH分离出来，而是单独进化出了这一功能。

我们的工作也弥补了关于细菌GBT分解代谢环境分布长期存在的知识差距，并调和了先前研究报告缺乏双加氧酶GbcAB的需氧细菌中 governing GBT去甲基化分子机制的不一致之处，但这些细菌仍然能够利用这种渗透剂作为营养和能源。我们提出只有SAR11细菌（缺乏MetH、MtgBCDE和钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶MetE）使用单一酶（Bhmt）将GBT去甲基化与甲硫氨酸合成耦合。固氮陆地alphaproteobacterium S. meliloti也被认为合成Bhmt用于直接耦合GBT去甲基化和甲硫氨酸合成；然而，Barra等人研究中提出的两个关键观察表明故事尚未完全解决。首先，GBT下调了metH表达，导致bhmt突变体在缺乏甲硫氨酸补充的其他碳源上生长时受到显著抑制。其次，向bhmt突变体补充甲硫氨酸使其在GBT上的生长达到与野生型相当的水平，作者指出必须存在一个 distinct GBT去甲基化途径。这些数据与我们的通过这种独特多聚体酶进行GBT去甲基化的模型一致，其中核心MtgC通过与MtgBCDE的相互作用将甲硫氨酸合成和GBT去甲基化相互连接。因此，在S. meliloti中，bhmt不是一个直接将GBT去甲基化与甲硫氨酸合成耦合的单一酶，而是与R. pomeroyi DSS-3和P. inhibens中的mtgE同源，作为一个多聚体酶上的模块发挥作用，后者已被实验证明对甲硫氨酸生物合成至关重要。这解释了为什么只有SAR11型Bhmt，而不是S. meliloti和其他海洋细菌同源物，保留了人类Bhmt中 essential for GBT binding 的残基。我们的模型因此解释了为什么在补充甲硫氨酸时，S. meliloti bhmt突变体中的GBT分解代谢不受影响，证明该基因（编码MtgE）对GBT去甲基化不是必需的。这一观察结果与我们GBT生长细胞的蛋白质组学数据一致，其中MtgE的相对丰度下降，而不像MtgBCD全部增加。

MtgC与其他已知钴胺素依赖性酶的同源性以及钴胺素合成及其还原再活化所需蛋白质的诱导，强烈表明该酶需要钴胺素，进一步连接了全球海洋中各种代谢物和相互作用的网络。MtgBCD存在于基因组精简的远洋玫瑰杆菌中，这些菌是B₁₂营养缺陷型，在基因组缩减过程中丢失了钴胺素合成基因，但随后获得了“功能获得”的钴胺素转运蛋白以“外包”合成代谢。可以推测，GBT代谢的生态效益有助于钴胺素摄取系统的固定，从而使它们能够扩大其代谢生态位并利用浮游植物衍生的营养。通常被视为钴胺素来源的细菌， also acted as a considerable sink，在南大洋以与真核微藻相似的速率吸收这种维生素。如此高的吸收因此可以通过缺乏cob操纵子的细菌中MtgBCDE的合成来解释，尽管这仍有待实验验证。

除了典型的MetE，最近在厌氧细菌、古菌和真核微藻中发现了几种类似于截短C末端MetE的钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶，命名为core-MetE和MetE-fusion。典型MetE的同源物仅在少数海洋耐腐菌中发现，这些菌通常也拥有MetH，例如Hyphomicrobiales和Vibrionales。然而，core-MetE蛋白的同源物（拥有活性所需的四个保守残基（Cys, His, Cys, Glu））可以在几个全球性海洋细菌中找到。这些同源物是否在需氧海洋细菌中起作用是有疑问的，因为尽管P. inhibens基因组中存在一个这样的同源物，但先前显示当mtgCDE突变时它是甲硫氨酸营养缺陷型。然而，可以推测这些仅在钴胺素限制下合成，类似于真核微藻中的MetE-fusion蛋白，作为对钴胺素稀缺的适应。

在R. pomeroyi DSS-3和其他编码mtgC和mtgD的海洋细菌中，经常发现多个（最多七个）含有MtgB中发现的pfam06253结构域的ORF。这表明多样的甲基化化合物也可能通过这种钴胺素依赖性途径被分解代谢，通过随后的H₄F连接的C1氧化途径作为能源，扩大了这种维生素在介导整个海洋生物地球化学反应中的重要性。作为支持，厌氧Eubacterium spp.也拥有更多数量的MtgB样同源物（MtpB, MtbB, MtyB, MtcB, MthB），它们优先去甲基化脯氨酸甜菜碱、GBT、γ-丁酰甜菜碱、肉碱和磷酸胆碱，所有这些都通过与单一核心钴胺素结合MtgC亚基的相互作用进行。

总之，我们报告了在Pelagibacteraceae家族之外的全球性海洋异养生物中发现了GBT分解代谢与甲硫氨酸合成之间的意外联系。除了揭示自然界中GBT去甲基化的主要途径外，我们的结果还扩大了钴胺素在全球海洋中的已知重要性。