PI31表达通过稳定突触蛋白酶体功能对早发性帕金森综合征小鼠模型发挥神经保护作用

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：PI31 expression is neuroprotective in a mouse model of early-onset parkinsonism

本研究揭示FBXO7（PARK15）突变导致早发性帕金森综合征的分子机制，发现其通过破坏PI31稳定性进而损害突触蛋白酶体运输功能。研究表明神经元中转基因表达PI31能有效挽救Fbxo7缺失引起的神经退行性病变，显著改善运动功能并延长寿命四倍。该发现为治疗神经退行性疾病提供了以PI31通路为靶点的新策略。

　　

Significance

FBXO7/PARK15基因突变是人类早发性帕金森综合征的致病原因。通过果蝇和小鼠条件性基因敲除模型，本研究证明FBXO7缺陷会导致PI31蛋白稳定性下降、突触蛋白酶体运输功能受损以及tau蛋白过度磷酸化。在神经元中转基因表达PI31能够防止神经退行性变，显著改善运动表现和突触完整性，并将全身性Fbxo7基因敲除小鼠的寿命延长达四倍。这些发现揭示PI31是FBXO7下游的关键神经保护因子，表明刺激突触局部蛋白酶体活性可以抑制神经退行性疾病中的突触功能障碍，为治疗早发性帕金森综合征及相关疾病提供了新的理论基础和治疗框架。

Abstract

神经退行性疾病是全球最重大的健康挑战之一，其特征是异常蛋白聚集物的积累，这些聚集物损害突触功能并导致进行性神经元变性。因此，刺激蛋白清除机制可能具有神经保护作用。FBXO7/PARK15基因变异会导致人类早发性帕金森性神经退行性疾病——帕金森锥体束综合征，而在小鼠中灭活该基因可重现患者的许多表型。蛋白酶体调节因子PI31是Fbxo7的直接结合伴侣，通过介导神经突中的快速蛋白酶体运输来促进突触部位的局部蛋白降解。当Fbxo7功能受损时，PI31蛋白水平会降低。本研究显示，在Fbxo7突变型果蝇和小鼠品系中恢复PI31水平能够防止神经元变性，并显著改善神经元功能、健康状况和寿命。值得注意的是，小鼠神经元中Fbxo7的失活会导致tau蛋白的过度磷酸化，而这种现象可通过转基因表达PI31来抑制。研究结果证明PI31是Fbxo7缺陷驱动病理过程的关键生物学靶点，针对PI31通路的治疗可能成为治疗神经退行性疾病的一种有前景的策略。

引言背景

大多数与年龄相关的神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化（ALS），其定义特征都是异常蛋白聚集物的积累。这些沉积物被认为直接或间接反映了神经毒性蛋白聚集体的存在。然而，病理性蛋白积累的确切机制及其毒性本质仍然难以捉摸。尽管这些疾病影响不同类型的神经元，但它们都始于与突触和树突棘病理相关的突触效能改变，表明突触功能障碍是一个共同且早期的疾病机制。此外，这些疾病中的各种病理性聚集体和沉积物都含有多聚泛素化（poly-Ub）蛋白，表明这些蛋白曾被标记待销毁但逃脱了蛋白酶体介导的降解。一种可能的解释是突触部位局部蛋白酶体活性不足启动了多聚泛素化聚集体的形成。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是细胞降解不需要的、受损的以及潜在毒性细胞内蛋白的主要机制。新蛋白在突触处既被合成也被蛋白酶体局部降解，这一过程对突触功能和可塑性至关重要。Bingol和Schuman最初证明蛋白酶体通过主动运输被快速招募到突触。蛋白酶体结合蛋白PI31（31kD的蛋白酶体抑制剂）作为衔接蛋白，直接将26S蛋白酶体与马达蛋白偶联，并介导蛋白酶体在轴突和树突中的快速运输。尽管PI31最初因其在体外抑制20S蛋白酶体核心颗粒对小肽的水解能力而被鉴定，但随后研究表明它在植物、酵母、果蝇和小鼠等多种生物体中促进蛋白分解。PI31刺激19S和20S颗粒组装成26S蛋白酶体，并且是轴突和树突中蛋白酶体运输所必需的。重要的是，破坏这一过程会损害突触蛋白稳态，并导致果蝇和小鼠的进行性神经元功能障碍和变性。

此外，PI31活性降低与人类疾病直接相关。编码PI31的基因PMSF1及其保守的直接结合伙伴FBXO7的双等位基因变异都会导致早发性神经退行性疾病。根据变异的严重程度，人类的神经系统症状范围从具有神经系统表现的围产期致死到早发性PD/帕金森综合征。Fbxo7直接结合PI31，其失活导致PI31的蛋白水解切割和水平降低。这表明Fbxo7的缺失可能通过降低PI31功能而引起疾病。在这种情况下，增加PI31蛋白水平预计会减轻Fbxo7的表型。

Results

Elevated PI31 Can Compensate for the Conditional Loss of nutcraker/FBXO7 in Drosophila Motor Neurons.

果蝇Fbxo7的同源基因nutcracker（ntc）的失活会导致运动缺陷、 dramatically 缩短寿命，并与线粒体缺陷相关。为了检测ntc对蛋白酶体轴突运输的需求，我们使用Prosβ5-RFP报告基因（一种与红色荧光蛋白融合的蛋白酶体亚基）对轴突中的蛋白酶体运动进行了活体成像。在复合杂合幼虫ntc^f07259/ms771中失活ntc会显著降低轴突中蛋白酶体的运动性。蛋白酶体的顺向和逆向运动都严重减少，而静止的蛋白酶体颗粒数量增加。这些表型与PI31^?/?和LC8动力蛋白轻链同源物dDYNLL1/ctp^?/?运动神经元中看到的表型非常相似。接下来，我们测试了增加PI31水平是否可以通过添加一个或两个拷贝的UAS-PI31转基因来挽救ntc^f07259/ms771的蛋白酶体运输缺陷。确实，两个拷贝的UAS-PI31转基因挽救了ntc^f07259/ms771的顺向蛋白酶体运输，改善了逆向运输，同时减少了静止颗粒的数量。在ntc^f07259/ms771幼虫轴突中观察到大的肿胀和Prosβ5-RFP阳性的聚集体，这一表型也被两个拷贝的UAS-PI31转基因所挽救。

Transgenic PI31 Expression Can Suppress Neurological Phenotypes in Fbxo7 Null Motor Neurons.

Fbxo7的失活导致位点特异性的、失活的蛋白水解切割和PI31蛋白水平的降低。为了进一步探讨PI31和Fbxo7在功能上相关联的观点，我们比较了PI31失活和Fbxo7失活所产生的表型，发现它们非常相似。与Fbxo7突变小鼠一样，在PI31^fl/fl;Ubc^CreERt2成年小鼠中诱导全身性PI31缺失会导致睾丸和胸腺大小急剧减小，并具有相似的组织病理学。此外，在PI31^fl/fl;Hb9^Cre/+小鼠的运动神经元中灭活Fbxo7产生的表型与我们之前报道的PI31在运动神经元中失活的表型高度相似。与PI31^fl/fl;Hb9^Cre/+小鼠一样，Fbxo7^fl/fl;Hb9^Cre/+小鼠以预期的孟德尔比率出生，最初没有表现出明显的运动功能障碍。出生4周后，体重差异、脊柱后凸（kyphosis）和运动问题变得明显，并随着年龄增长而逐渐加重。使用全mount荧光共聚焦成像检查胸骨三角形肌（triangularis sterni）的运动神经支配，揭示了突触结构的丧失、轴突肿胀、轴突发芽以及神经肌肉接头（NMJ）及其附近大的p62颗粒，这与PI31^fl/fl;Hb9^Cre/+小鼠非常相似。因此，运动神经元特异性缺失Fbxo7或PI31会产生几乎相同的表型。

由于Fbxo7的失活降低了PI31的水平，我们认为在Fbxo7^fl/fl;Hb9^Cre/+中看到的至少部分神经元病理可能是由PI31功能降低引起的。如果是这样，异位表达PI31应该能够至少部分挽救Fbxo7缺陷。为了验证这一假设，我们产生了条件性表达Flag标记的PI31（TgPI31）的转基因小鼠。由于Hb9^Cre等位基因纯合不可存活，我们使用Chat^Cre驱动子来增加具有所需基因型的动物数量。Chat^Cre比Hb9^Cre具有更广泛的表达模式，包括脊髓运动神经元以及所有其他胆碱能神经元。正如预期，生理和细胞表型都比Hb9^Cre更严重。为了验证TgPI31表达且功能正常，测试了其挽救PI31突变小鼠的能力。TgPI31构建体表达了预期大小的蛋白，并且能够完全挽救PI31^fl/fl;Chat^Cre突变小鼠，证明转基因蛋白具有生物活性。接下来，我们将TgPI31与Fbxo7^fl/fl;Chat^Cre小鼠杂交以测试可能的挽救效果。Fbxo7^fl/fl;Chat^Cre以预期的孟德尔比率出生，并且在出生后的前3周与对照同窝小鼠相似。然而，从4周龄开始，突变小鼠体重增加停滞，到8周龄时由于健康状况不佳而不得不被安乐死。Fbxo7^fl/fl;Chat^Cre小鼠的表型在细胞和行为水平上都与PI31^fl/fl;Chat^Cre小鼠非常相似。特别是，Fbxo7^fl/fl;Chat^Cre小鼠NMJ的突触结构高度异常，神经元显示出病理标志，如轴突肿胀和发芽。虽然Fbxo7^fl/fl;Chat^Cre发展出进行性运动神经元疾病，但Fbxo7^fl/fl;TgPI31;Chat^Cre小鼠实际上与对照动物无法区分，并且在8周时没有出现任何可检测到的运动功能障碍。肌肉神经支配的显微照片证实，转基因挽救动物的NMJ是完整的，并且看起来与正常对照相似。我们得出结论，在Fbxo7缺失的运动神经元中表达PI31可以抑制轴突变性，保护神经元功能和机体健康。

Transgenic Expression of PI31 Suppresses Phenotypes of Panneuronal and Whole-Body Inactivation of Fbxo7.

引起人类疾病的FBXO7变异主要因其损害中枢神经系统（CNS）中神经元的功能和存活而受到临床关注。为了测试PI31是否能保护 against 所有神经元中Fbxo7缺失导致的神经表型，我们使用了全神经元特异性Cre转基因Actl6b^Cre（BAF53b^Cre）。使用该驱动子可以同时灭活所有神经元中的Fbxo7并驱动TgPI31表达。使用该驱动子条件性缺失Fbxo7产生的表型与全身性Fbxo7敲除小鼠[Fbxo7^{tm1b(EUCOMM)Hmgu}（Fbxo7^KO/KO (tm1b)）和Fbxo7^{tmd(EUCOMM)Hmgu}（Fbxo7^KO/KO (tm1d)）非常相似，表现为出生后第11天（P11）后体重增加停滞、死亡率和运动缺陷。P5后，Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre小鼠的体重增长迟缓，从P14开始提供湿粮的情况下，平均在23.28天（中位数23天）死亡。在Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre/+小鼠中，单个拷贝的TgPI31增加了体重，并将中位寿命延长至42天。在P20时，Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre/+小鼠在旋转棒（rotarod）上表现出更快的跌落潜伏期，表明存在运动缺陷。与Fbxo7^KO/KO (tm1b)小鼠不同，当通过旷场实验（open field assay）评估P20 Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre/+小鼠的运动时，它们显示出总移动距离的增加。这与在谷氨酸能前脑神经元中条件性缺失Fbxo7所报道的多动行为更为一致。然而，尽管Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre/+小鼠比对照小鼠移动得更远，但它们显示出垂直活动（即 rearing and jumping）的减少，这与后肢功能缺陷和站立时平衡能力差相一致。我们发现所有这些表型都可以通过在Fbxo7^fl/fl; TgPI31/+; Actl6b^Cre/+小鼠中条件性表达PI31来抑制。正如在Fbxo7^KO/KO (tm1b)小鼠中报道的那样，我们也在P18 Fbxo7^fl/fl; Actl6b^Cre/+小鼠大脑中观察到星形胶质细胞增生的增加，而外源性PI31表达也抑制了这一点。因此，PI31可以抑制CNS中以及外周神经元中Fbxo7缺失自主性（autonomously）引起的表型。

Fbxo7的缺失会导致神经元以外的其他细胞功能异常。例如，特异性条件性消融髓鞘形成胶质细胞、少突胶质细胞和施万细胞中的Fbxo7可导致神经元变性。在证明了PI31在神经元中自主性抑制Fbxo7缺失的能力后，我们接下来测试了PI31是否能抑制全身性Fbxo7缺失。为此，我们产生了组成型表达PI31转基因（TgPI31cs）的小鼠。我们实验室先前证明，PI31的缺失会导致小鼠胚胎发育晚期致死。为了测试TgPI31cs是否能挽救PI31敲除小鼠（PI31^KO/KO）（Psmf1^{tm1d(EUCOMM)Hmgu}），将PI31^KO/+; TgPI31cs/+小鼠与PI31^KO/+; TgPI31cs/+小鼠杂交，以产生带有一个或两个拷贝TgPI31cs的PI31^KO/KO小鼠。TgPI31cs挽救了PI31^KO/KO小鼠的胚胎致死性，出生的小鼠看起来正常。在P40时，带有TgPI31cs的PI31^KO/KO小鼠在旋转棒上的表现与其野生型（w.t.）同窝小鼠一样好。

然后我们测试了TgPI31cs转基因是否能挽救Fbxo7敲除小鼠（Fbxo7^{tm1d(EUCOMM)Hmgu}, Fbxo7^KO/KO (tm1d)）。观察到的Fbxo7^KO/KO (tm1d)表型与FBXO7^KO/KO (tm1b)报道的一致。P5后，Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠体重增加甚微（从P14开始每天提供湿粮）。到P18时，雄性小鼠平均体重为4.8克，而对照小鼠在P18时体重为9克。Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠平均在21.7天（中位数22天）死亡。没有Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠活过P24。一个拷贝的TgPI31cs使得雄性Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠在P18时达到平均7克的体重，到P28时增加到9.3克，而对照小鼠在P28时平均为17.5克。这些小鼠将体重维持到生命的最后几天，平均寿命为46.6天（中位数45天）。一个拷贝的TgPI31cs使Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠的寿命延长了一倍。当小鼠杂交以允许有两个拷贝的TgPI31cs时，可以区分出两个不同的被挽救的Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠群体。一个群体与上述带有一个拷贝TgPI31cs的Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠相匹配。第二个群体，推测是那些带有两个拷贝TgPI31cs的小鼠，显示出对Fbxo7^KO/KO (tm1d)表型的更强抑制。因此，到P28时，带有两个拷贝TgPI31cs的小鼠可以很容易地与携带单个拷贝的小鼠区分开来。该群体的雄性小鼠在P56时达到平均14.8克，而对照小鼠为20.4克。它们将体重维持到生命的最后几天，平均寿命为87.6天（中位数89天）。因此，两个拷贝的组成型TgPI31使Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠的寿命延长了四倍。这证明了PI31对Fbxo7^KO/KO (tm1d)表型抑制的剂量敏感性。最后，用旷场实验测试了Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠的运动能力，与全神经元条件性小鼠一样，它们表现出总移动距离的增加和垂直活动的缺陷。这种多动和垂直活动缺陷也被一个或两个拷贝的TgPI31cs所抑制。

Tau, a Biomarker for Neurodegenerative Diseases, Is Hyperphosphorylated in Brains of Fbxo7 Null Mice and This Phenomenon Is Suppressed by Transgenic Expression of PI31.

Fbxo7或PI31功能降低会导致早发性帕金森综合征，并伴有额外的神经和认知症状。PI31的变异也在一项全基因组关联研究中与AD相关联。微管相关tau蛋白在各种神经退行性疾病中变得过度磷酸化，并作为驱动这些疾病的生物标志物。因此，我们检查了Fbxo7缺失大脑与对照相比的tau蛋白状态。首先，我们使用Tau-1抗体，该抗体仅当其表位在Ser195、Ser198、Ser199、Ser202和Thr205未磷酸化时才能识别。使用Tau-1，在Fbxo7缺失神经元中与对照相比观察到染色显著减少。这一结果与tau磷酸化响应Fbxo7功能丧失而发生的改变一致。为了进一步检验这种可能性，我们使用Ser199-Ser202磷酸化依赖性tau抗体（Thermo Fisher 44-768G）以及识别总tau蛋白的抗体（Encor MCA-5B10）对P20 Fbxo7^KO/KO (tm1d)大脑提取物进行了Western blot分析。该分析揭示了Fbxo7^KO/KO (tm1d)大脑提取物中Ser199和Ser202磷酸化tau的明显增加。显著的是，tau的过度磷酸化在Fbxo7^KO/KO (tm1d)中被TgPI31cs转基因抑制。使用识别Ser202和Thr205磷酸化tau的AT8抗体，在Fbxo7缺失神经元中也观察到tau磷酸化增加的证据。我们得出结论，神经元中Fbxo7的失活导致tau的过度磷酸化，这可能是导致Fbxo7缺陷病理的机制之一。值得注意的是，通过转基因表达适度提高PI31蛋白水平抑制了tau的过度磷酸化。我们再次注意到，当Fbxo7失活时，内源性和转基因PI31的蛋白水平都降低，这与我们早期的结果一致，即当PI31与Fbxo7的直接结合被破坏时，PI31会经历位点特异性的蛋白水解切割和降解。值得注意的是，内源性PI31通过增加转基因PI31的表达在Fbxo7^KO/KO (tm1d)小鼠中得到稳定，可能是通过滴定（titrating）PI31降解的限速因子。总的来说，这些结果表明，由于Fbxo7功能受损导致的PI31水平降低在驱动病理和tau过度磷酸化中起着突出作用，并且适度升高的PI31水平在该模型中具有神经保护作用。

Discussion

FBXO7的变异已在患有家族性PARK15（一种罕见的伴有锥体束受累的早发性帕金森综合征）的人类患者中被鉴定出来。本研究显示，蛋白酶体调节因子PI31的转基因过表达在该疾病的Fbxo7动物模型中具有神经保护作用。特别是，适度增加PI31表达能够抑制果蝇和小鼠Fbxo7缺失突变体中的神经变性，甚至在完全敲除的动物中也是如此。这种效应出奇地强，因为2个拷贝的PI31转基因将“Fbxo7全身性KO”小鼠（即所有细胞中Fbxo7失活的小鼠）的存活期延长了大约四倍：Fbxo7缺失动物在P22左右死亡，而在带有两个PI31转基因拷贝的动物中延长至超过89天。在抑制体重减轻和运动性能方面也看到了同样显著的效果。值得注意的是，转基因PI31蛋白的水平相当适度，与内源性蛋白水平相当。在带有一个拷贝转基因的Fbxo7^KO/KO小鼠中，总PI31是对照小鼠内源性PI31的82%。此外，对Fbxo7表型的挽救对转基因拷贝数非常敏感，揭示了明显的剂量敏感性。值得注意的是，适度的PI31过表达水平（2至5倍）在果蝇和小鼠中都能很好地耐受，在整个动物寿命期内没有检测到明显的有害影响。

PI31通过至少两种机制刺激体内蛋白分解。首先，PI31促进19S和20S亚基组装成26S颗粒，26S颗粒是负责调节性降解多聚泛素化细胞内蛋白的主要蛋白水解机器。其次，PI31将蛋白酶体直接与微管基马达偶联，从而介导蛋白酶体在细胞体和突触之间的快速双向运输。PI31直接结合蛋白酶体和Fbxo7，并且PI31和Fbxo7在轴突中富集。PI31的失活会阻断蛋白酶体运输，破坏突触蛋白稳态，刺激聚集体形成，并导致进行性神经元功能障碍并最终导致细胞死亡。这些观察结果提出了以下工作模型。PI31活性降低会减少突触处活性蛋白酶体的可用性，这增加了被标记待销毁的多聚泛素化蛋白逃脱蛋白酶体降解并形成聚集体的可能性。由于许多聚集倾向的神经毒性蛋白的寡聚体可以直接抑制蛋白酶体，可能会产生蛋白毒性应激增加的前馈循环，从而使情况变得更糟。尽管突触蛋白聚集体可以通过自噬-溶酶体途径（ALP）去除，但这需要自噬体的逆行运输，因为突触处没有成熟的溶酶体。此外，ALP不能替代蛋白酶体介导的突触蛋白水平的局部调节。随着时间的推移，并可能受到其他遗传因素、环境和应激的影响，在突触处逃脱蛋白酶体介导降解的蛋白质预计会逐渐损害突触功能和长期存活。应该指出的是，突触也含有游离的神经元19S调节颗粒，它们以不依赖降解的方式改变突触传递。虽然PI31直接结合20S颗粒并介导单帽26S蛋白酶体的运输，但我们不能排除在Fbxo7和PI31缺失神经元中对19S颗粒的影响。最后，我们还考虑了PI31可能影响未加帽的20S神经元膜结合蛋白酶体（NMP）的可能性，这些蛋白酶体与受损和/或非