结构多样的病毒抑制剂通过共同机制阻断抗原转运蛋白TAP的功能

本研究发现四种序列和结构各异的病毒蛋白（BNLF2a、hUS6、bUL49.5、CPXV012）通过冷冻电镜技术解析了其与抗原加工相关转运体（TAP）的复合物结构，揭示了病毒免疫逃逸的趋同进化策略。这些抑制剂虽靶向TAP不同构象状态（内向型或外向型），但均通过占据肽结合位点（N-pocket和C-pocket）阻断其交替存取（alternating access）循环，为针对持续性感染的抗病毒药物设计提供了分子框架。

　　

Significance

抗原加工相关转运体（TAP）在将肽段转运至内质网以加载到主要组织相容性复合物I类（MHC-I）分子中起着关键作用，因此成为病毒免疫逃逸策略的常见靶标。本研究揭示了四种独特病毒蛋白（各自具有不同序列和结构）如何结合并抑制TAP。比较它们的作用模式揭示了一种趋同进化策略。抑制剂与TAP相互作用的分子细节定义了TAP上的结合热点，这些热点不仅使转运体易受病毒靶向，也可能在药物设计中被利用以恢复持续性感染中的抗原呈递。

Abstract

在宿主-病原体军备竞赛中，疱疹病毒和痘病毒编码的蛋白质通过破坏抗原加工相关转运体（TAP）来抑制MHC-I抗原呈递，从而实现终身感染。在五种已知的病毒TAP抑制剂中，仅疱疹 simplex 病毒（HSV）蛋白ICP47的结构已被解析。本研究现报告了TAP与其余四种抑制剂复合物的冷冻电镜结构：BNLF2a（Epstein-Barr病毒）、hUS6（人巨细胞病毒）、bUL49.5（牛疱疹病毒1型）和CPXV012（牛痘病毒），从而组装了一个病毒TAP逃避的结构图谱。尽管这些病毒抑制剂采用不同的序列、折叠和构象靶点，但它们汇聚于一个共同策略：将TAP阻滞在交替存取循环中，阻止肽段进入内质网，并使受感染细胞免受细胞毒性T细胞监视。这些发现揭示了显著的功能趋同性，并为合理的抗病毒设计提供了结构框架。

A Protein-Tethering Strategy to Stabilize TAP/Inhibitor Complexes

为了进行TAP/病毒抑制剂复合物的冷冻电镜研究，研究人员开发了一种使用SpyCatcher/SpyTag系统的拴系策略。将TAP1核苷酸结合域（NBD）的C末端与SpyCatcher融合，并将每种病毒抑制剂的胞质末端与SpyTag融合。当两个模块因TAP/抑制剂结合而接近时，会形成共价键，防止复合物解离。正如预期，共价TAP/抑制剂复合物在细胞中有效形成，这通过SDS-PAGE和荧光尺寸排阻色谱得以证实。通过流式细胞术评估了标记的TAP和抑制剂是否保持功能并在细胞中组装成复合物。TAP基因敲除（KO）细胞在细胞表面显示极少的MHC-I分子。表达TAP-SpyCatcher构建体将表面MHC-I恢复到与野生型（WT）TAP相当的水平。标记的病毒蛋白抑制了WT和SpyCatcher标记的TAP；除BNLF2a外，标记蛋白的活性与其未标记的对应物相似。标记BNLF2a观察到的活性轻微降低的潜在解释将在其结构背景下讨论。

EBV Protein BNLF2a Traps TAP in the Inward-Facing Conformation

EBV是一种γ疱疹病毒，在超过90%的成年人群中建立持续性感染。EBV编码几种下调抗原呈递的蛋白质，其中之一是TAP抑制剂BNLF2a。BNLF2a是一种尾部锚定蛋白，具有N末端胞质结构域和单次跨膜的C末端跨膜（TM）螺旋。同源物仅存在于旧世界灵长类γ疱疹病毒中，并且都能抑制人TAP。功能实验表明BNLF2a直接与核心TAP相互作用，并且抑制剂的胞质和跨膜结构域对于抑制都是必需的。

TAP/BNLF2a复合物的结构在无核苷酸情况下以3.7 ?的整体分辨率解析。TAP采用内向型、NBD分离的构象，与apo TAP结构非常相似，整体RMSD为0.96 ?。清晰的密度对应于BNLF2a，允许对病毒抑制剂除N末端五个残基外的部分进行建模。BNLF2a形状像鱼钩，残基5至27形成一个发夹结构，穿过TM腔约20 ?，然后环回。一个富含脯氨酸的区域（残基28至36）形成“弯曲”，通过TAP2 TM螺旋4和6之间的胞质开口退出TM腔。BNLF2a的C末端TM螺旋代表“弯曲”，沿着TAP2的外表面堆积并延伸至ER腔。

生化数据表明BNLF2a抑制肽结合，结构显示其通过占据与肽抗原相同的空间来实现这一点。TAP在内向型、NBD分离的构象中从胞质溶胶招募肽。不同序列的肽以类似方式结合，将其N和C末端锚定在TAP上的两个不同位点，称为N-pocket和C-pocket。BNLF2a的发夹结构插入肽结合腔，并通过主链和侧链相互作用的网络完全阻塞C-pocket。在结构中，BNFL2a的第一个有序残基，位于第5位的亮氨酸，距离TAP的N-pocket 10?。鉴于拴系策略在BNLF2a的N末端引入了SpyTag，在其天然的未拴系形式中，BNLF2a可能通过其游离的N末端与N-pocket结合，模拟肽抗原。确实，未标记BNLF2a结构的建模将其N末端置于N-pocket的氨基末端接受位点内。这种相互作用可以解释观察到的拴构建物与游离BNLF2a相比抑制活性降低的现象。

这些结构观察表明，与ICP47类似，BNLF2a的胞质结构域充当肽抗原的竞争性抑制剂。然而，与ICP47不同，BNLF2a需要TM锚定，因为仅胞质结构域（ΔTM）不足以抑制TAP。这种差异可能由BNLF2a与TAP之间较小的界面解释：BNLF2a埋藏的TAP溶剂可及表面积仅为1,387 ?²，约为ICP47（2,360 ?²）的60%。BNLF2a的TM螺旋提供了与TAP的额外界面，并将病毒抑制剂锚定在内质网膜中。含有合成聚亮氨酸螺旋或来自另一种尾部锚定蛋白的TM螺旋的嵌合BNLF2a构建体没有显示功能缺陷，表明只要BNLF2a整合到内质网膜中以增加其抑制性胞质结构域的局部浓度，TM螺旋的具体序列并不关键。

为了将肽释放到ER腔中，TAP经历重大的构象变化，包括在NBD二聚化时关闭TM4和TM6之间的胞质开口。在TAP/BNLF2a复合物中，这种构象变化很可能被阻断，因为富含脯氨酸的弯曲楔入TAP2 TM4和TM6之间，有效地将TAP卡在内向型状态。因此，BNLF2a通过直接竞争肽结合并阻止TAP向外面向构象转变来抑制TAP。

US6 of Cytomegalovirus Traps TAP in an NBD-Dimerized, Posthydrolytic Conformation

与EBV类似，人巨细胞病毒（HCMV）是一种临床上重要的疱疹病毒，在人类宿主中建立持续性感染。CMV的US6是一种I型TM蛋白，由一个大腔区域、一个TM螺旋和一个短的胞质尾部组成。诱变研究表明，与ICP47和BNLF2a不同，US6的抑制结构域完全位于其ER腔区域内，表明US6通过不同于ICP47和BNLF2a的机制运作。有趣的是，尽管序列存在显著差异，人US6（hUS6）和恒河猴CMV US6（rhUS6或RH185）都能抑制人TAP。为了深入了解US6介导抑制的分子基础，研究人员解析了TAP与hUS6或rhUS6结合的冷冻电镜结构，揭示了尽管它们序列同源性有限，但具有保守的作用模式。

两种结构均在存在10 mM ATP的情况下以约3 ?的分辨率解析。在两种情况下，TAP都呈现NBD二聚化的外向型构象，但其腔腔被病毒抑制剂完全堵塞。对于hUS6，这个塞子由其腔区域的102至136位残基组成，形成一个通过分子内堆积和两个保守半胱氨酸之间的二硫键稳定的大环。该区域外的残基在冷冻电镜图中不可见，表明它们高度灵活。这个结构化区域与先前研究高度一致，这些研究将hUS6的功能域定位在98-143之间。突变或移除该区域外的残基不影响MHC-I下调。此外，四丙氨酸扫描研究确定107至118位残基对TAP抑制尤为关键。该区域深入跨膜（TM）腔，与高度保守用于结合肽抗原的TAP残基相互作用。特别是，hUS6残基S117和R119插入带负电荷的N-pocket，而两个酸性残基D111和D113与C-pocket中的碱性残基相互作用。这些相互作用赋予了hUS6高亲和力，使其即使在没有TM锚或N末端区域的情况下也能抑制TAP。D111和D113在结合C-pocket中的关键作用进一步得到先前工作的强调，该工作表明将它们引入黑猩猩CMV US6中赋予了抑制人TAP的能力。

TAP/rhUS6复合物的结构也揭示了一个二硫键拴系的环，堵塞了TAP面向ER的腔。与其在人CMV中的同源物类似，rhUS6也通过静电相互作用与N-pocket和C-pocket中的残基相互作用。与hUS6相比，其主链原子遵循不同的轨迹并更深地下降到TM腔中，尽管整体形状和静电分布非常相似。rhUS6的一个独特特征是其良好有序的TM螺旋，紧密地堆积在TAP2的外表面。虽然截短或替换hUS6的TM螺旋没有功能后果——与先前研究一致——但rhUS6中的类似修改严重损害了其抑制功能。因此，虽然hUS6的TM螺旋在结构上未解析且对功能是非必需的，但rhUS6的有序TM螺旋对于有效的TAP抑制至关重要。

最后，先前的研究表明hUS6阻止TAP结合ATP。然而，我们对hUS6和rhUS6结合的TAP的冷冻电镜重建显示了对应于在简并位点结合的ATP和在共有位点结合的ADP的密度。这些观察表明US6并不直接阻断核苷酸结合本身。相反，US6结合将TAP捕获在NBD二聚化、水解后的状态，从而阻止核苷酸交换和后续肽转运所需的ATP水解循环。这种机制通过将转运体锁定在非活性构象而不是抑制ATP结合本身来有效停止TAP活性。

UL49.5 from Bovine Herpesvirus 1 is a Dual-Action Immune Evasion Protein

尽管牛疱疹病毒1型不是人类病原体，但它编码bUL49.5，一种I型TM蛋白，可抑制包括人在内的不同物种的TAP。bUL49.5在已知的病毒抑制剂中是独特的，因为它具有抑制肽转运和靶向TAP进行蛋白酶体降解的双重作用。研究已将这两种功能映射到不同的区域：N末端ER腔结构域和TM抑制肽转运，而C末端胞质尾部编码一个使TAP用于ER相关降解（ERAD）的降解决定子。C末端抑制剂截短无法降解TAP但仍结合并抑制转运体，表明bUL49.5是一种真正的TAP抑制剂。

从用TAP E632Q（EQ）变体与10 mM ATP孵育收集的单个冷冻电镜数据集中，观察到两种TAP/bUL49.5复合物结构。两者都显示NBD二聚化的TAP，其面向ER的腔被病毒抑制剂堵塞。两种结构在TAP2 TM3的局部构象上有所不同：在“未弯曲”构象中，TM3是连续的，而在“弯曲”构象中，TM3表现出急剧的内向弯曲，并通过抑制剂的存在以及TAP1的R467和TAP2的N267之间的相互作用来稳定。

在更普遍的“未弯曲”构象（占总颗粒的56%）中，TAP中的侧链和NBD二聚界面的两个ATP分子的密度定义良好。然而，bUL49.5的密度是不连续的，可辨别的特征仅限于TM螺旋和腔结构域。与US6类似，bUL49.5的N末端腔区域插入TM腔，穿透脂质双层超过20 ?。尽管bUL49.5的密度高度异质且不连续，N-pocket中的TAP1 W308与抑制剂形成清晰的接触。

在较少存在的“弯曲”构象（占总颗粒的27%）中，TAP类似地被捕获在面向ER的状态。与“未弯曲”复合物相比，TM腔内bUL49.5的密度定义更好，尽管仍不足以分配氨基酸序列。抑制剂密度的改善有序性可能源于与TAP更大的接触面积。除了W308，TAP中的几个其他残基也与抑制剂相互作用，包括N-pocket残基R312。

bUL49.5的TM螺旋仅在“未弯曲”重建中被解析，它沿着TAP2的外表面对角线堆积。在两个图中都没有观察到C末端降解决定子序列的密度。突变研究表明，bUL49.5的TM螺旋对于MHC-I下调是必需的，但其特定序列并不关键。与这一结论一致，我们发现删除TM螺旋会废除其抑制功能，而用聚亮氨酸螺旋替换它仍然有效抑制TAP。与文献一致，我们还观察到通过R93K取代消除C末端降解决定子会削弱bUL49.5的抑制，表明促进TAP降解是bUL49.5下调MHC-I表面表达机制的重要组成部分。膜锚定的必要性以及bUL49.5腔结构域的无定形密度表明bUL49.5与TAP之间的特定相互作用是低亲和力的，可能使其成为比其他病毒抑制剂更弱的抑制剂。然而，这种较弱的抑制功能被胞质降解决定子所补偿，该降解决定子将TAP靶向用于ERAD。

bUL49.5的双重作用，直接抑制肽转运和降解TAP，也可能解释其对多种TAP直系同源物的更广泛特异性。例如，人和牛TAP共享约75%的整体序列同一性。bUL49.5结合口袋，主要由两个TAP亚基的螺旋3和6形成，在几个直接接触病毒抑制剂的位点上有所不同。我们推测bUL49.5可能对牛TAP具有更高的亲和力，因为牛疱疹病毒1型主要感染牛而不是人，进化压力将有利于适应其自然宿主。尽管如此，直接抑制和靶向降解的组合机制使bUL49.5能够抑制不同物种的MHC-I表面呈递，即使TAP结合亲和力相对较低。

CPXV012, a TAP Inhibitor From the Cowpox Virus

在疱疹病毒科之外，痘病毒科的牛痘病毒编码几种免疫逃避蛋白，包括TAP抑制剂CPXV012。感染牛痘病毒虽然在健康人群中大多良性，但在免疫受损患者中可能是致命的。69残基的蛋白质CPXV012包含一个N末端TM螺旋和一个C末端ER腔结构域。共免疫沉淀测定已证明CPXV012直接与TAP相互作用；然而，其精确的功能结构域和抑制机制仍然定义不清。一种模型表明TM螺旋促进与TAP的结合，而C末端十个残基通过模拟高亲和力肽来抑制。相反，另一项研究提出TM螺旋在很大程度上是非必需的，腔结构域与脂质膜的相互作用是必需的。这些不同的观点凸显了进一步结构和功能研究的需要。

TAP(EQ)/CPXV012的结构在存在10 mM ATP的情况下以3.0 ?的分辨率解析。与US6和bUL49.5类似，病毒抑制剂通过其ER腔结构域将TAP稳定在外向型构象，该结构域形成一个明确定义的螺旋，插入TAP的TM腔约25 ?。没有观察到N末端40个残基的密度，表明它们是灵活的，并且不与TAP形成稳定的相互作用。由残基45至61组成的螺旋紧密地堆积在TAP1 TM1、3、6和TAP2 TM1、2、4上。在一个急剧弯曲之后，CPXV012的C末端七个残基穿过TM腔并到达C-pocket。病毒抑制剂的末端羧基与C-pocket残基TAP2 N269和R273形成两个氢键。N-pocket也被病毒抑制剂占据，侧链R59模拟肽的游离氨基基团，与TAP1 W308形成阳离子-π相互作用，并与TAP1 E242形成氢键。

与无抑制剂结构相比，CPXV012结合时的构象变化发生在TMD的ER腔半部分局部。最大的变化在TAP1 TM1之后的腔环，它向抑制剂摆动约45°。此外，TAP2 TM5和TM6向内移动以与螺旋直接接触。因此，将肽结合位点打开到ER腔的TM腔现在被病毒抑制剂阻塞。

TAP和病毒抑制剂之间的界面是广泛的（2,106 ?²），单丙氨酸取代测定表明几个残基对抑制至关重要。其中，位于螺旋顶部的C45与TAP1腔环1相互作用。位于螺旋手柄同一面上的Y47和K51与TAP2 Q388和E417形成氢键网络。这些残基直接参与稳定抑制剂结合时诱导的构象变化。此外，由R59介导的与N-pocket的相互作用，以及由W49、H53和L56介导的与TAP1的接触也很重要。这些残基中任何一个的丙氨酸取代都显著降低了CPXV012的抑制，支持整个腔结构域——而不仅仅是C末端10个残基——对抑制至关重要的模型。

虽然我们没有观察到TM螺旋的EM密度，但MHC-I呈递测定揭示抑制剂的膜锚定——无论是通过其天然TMD序列、聚亮氨酸螺旋还是sigma-1受体（S1R）的TMH——对于完全抑制是必需的。这些数据与先前的一项研究一致，表明虽然功能片段位于腔结构域中，但TM螺旋通过以很大程度上序列无关的方式将抑制剂定位到ER膜来增强效力。

Discussion

五种已知的病毒TAP抑制剂，由疱疹病毒和痘病毒家族的成员编码，提供了功能趋同进化的一个显著例子。尽管没有序列或结构同源性，这些蛋白质独立地获得了通过TAP阻断抗原呈递的能力。本研究中呈现的结构汇编了病毒TAP抑制的结构图谱，并揭示了类似选择压力如何产生趋同生化解决方案的分子基础。

与早期的生化分析一致，结构显示病毒TAP抑制剂在其转运循环的不同阶段阻滞转运体。来自HSV的ICP47和来自EBV的BNLF2a结合内向型、NBD分离的“静息”状态，阻塞胞质前庭，从而阻止肽结合和NBD二聚化。相比之下，来自hCMV的hUS6、来自牛痘病毒的CPXV012和来自牛疱疹病毒1型的bUL49.5捕获处于外向型、NBD二聚化的构象中的TAP，该构象通常支持肽释放到ER中。这些抑制剂插入ER腔并稳定外向型状态，防止其重置以进行后续的肽转运轮次。除ICP47外，所有抑制剂都受益于通过TM螺旋进行的ER锚定。膜拴系增加了抑制剂在ER膜上的局部浓度，并且在bUL49.5的情况下，将蛋白质与胞质降解模块连接起来。

尽管它们靶向转运循环的相反末端，所有五种蛋白质汇聚于一个共同机制：通过将TAP锁定在单一构象中，它们停止其交替存取循环并废除肽转运。这种封锁使病毒能够逃避细胞毒性T淋巴细胞监视并在宿主中建立终身持久性。由于TAP在脊椎动物中高度保守，编码TAP抑制剂的 zoonotic 病毒，尽管其序列同一性有限，要么已经抑制人TAP，要么只需要微小的适应即可做到这一点。这些发现对病毒进化以及具有免疫逃避性病原体的人畜共患潜力具有重要意义。

这些病毒抑制剂中一个反复出现的机制主题是它们利用TAP肽结合位点作为锚定点。在本研究中，我们证明TAP的N-pocket和C-pocket，富含通常协调肽抗原游离末端的带电残基，经常被病毒蛋白利用以增强结合亲和力。这些带电表面要么通过蛋白质的N或C末端，要么通过模拟天然底物相互作用的带相反电荷的侧链来结合。这种策略不仅空间阻塞了转运途径，而且在许多情况下还稳定了与转运不相容的TAP构象。这些结构和进化上无关的抑制剂反复靶向这些底物识别元件，突显了TAP转运循环中的一个共同脆弱点。理解这些反复出现的策略可能指导免疫调节治疗剂的设计，这些治疗剂模仿或破坏这些病毒机制，以在自身免疫中抑制或在癌症和传染病中增强抗原呈递。