人iPSC源性心脏特异性细胞外基质支架：推动心肌细胞成熟与心肌梗死修复的创新策略

本研究针对心肌梗死（MI）后成年心肌再生能力有限、现有工程化心脏补片因支架成分单一和结构缺乏组织性而疗效受限的问题，开发了一种源自人诱导多能干细胞分化的心脏成纤维细胞（hiPSC-CF-ECM）的生物活性、各向异性细胞外基质（ECM）支架。该支架结合了心脏特异性蛋白、生长因子与复杂结构组成，显著促进了hiPSC来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的成熟，并在免疫正常大鼠MI模型中有效保留了心脏功能、提高了射血分数、减少了不良重塑。这一成果为心脏组织工程和MI治疗提供了一种有前景的仿生支架策略。

　　

心肌梗死（Myocardial Infarction, MI）是全球范围内导致心力衰竭和死亡的主要原因之一，其根本原因在于成年心肌组织的再生能力极其有限。当前，针对终末期心衰的治疗手段主要依赖于左心室辅助装置植入或心脏移植，但这些方法不仅资源稀缺，还伴随着巨大的手术风险和危及生命的并发症。近年来，人类诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）技术的突破为心衰治疗带来了新的希望，科学家们已经能够将hiPSCs分化为功能性的心肌细胞（cardiomyocytes, CMs），并将其移植到衰竭的心脏中以实现修复。尽管在大型动物模型中已经实现了大规模、高纯度的hiPSC-CMs移植并观察到心肌再生现象，但治疗效果仍然受限，主要挑战在于难以实现移植细胞的充分成熟以及避免移植相关的心律失常。

现有的生物材料策略，如使用胶原、纤维蛋白等天然心脏ECM蛋白组成的水凝胶，虽然具有一定的生物活性，但仍无法完全模拟天然心脏ECM所提供的生化和生物物理信号。天然心脏ECM不仅为心脏细胞提供机械支持，还通过细胞表面受体介导的信号传导，精确调控包括CMs、心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs）、内皮细胞和免疫细胞在内的多种心脏细胞的增殖、成熟和分化。因此，ECM的组成显著影响其再生效果。研究表明，胎儿和新生大鼠的心脏ECM由于含有更多的纤连蛋白和emillin-1、更少的胶原I，能够更有效地促进心肌细胞增殖；而具有心肌再生能力的斑马鱼心脏ECM则因含有更多的弹性蛋白和糖胺聚糖、更少的胶原，能够改善小鼠心脏的再生能力。

为了更好地模拟关键的心脏微环境，研究人员尝试将hiPSC-CMs与CFs共培养，虽然在一定程度上改善了CMs的功能成熟和收缩性，但CFs的直接共培养对心律失常发展的影响尚不明确，甚至有些研究表明CFs可能促进心律失常的发生。为了规避CFs可能带来的致心律失常风险，研究人员转而使用来自人心室心肌的去细胞化ECM颗粒与hiPSC-CMs共培养，结果显示CMs表现出更长的肌节和改善的钙处理能力。然而，这些方法破坏了天然心肌ECM的结构完整性，而ECM的各向异性结构对于实现CMs的有序排列和定向机械收缩至关重要。

为了克服这些挑战，本研究团队开发了一种基于人诱导多能干细胞来源的心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）的细胞源性ECM支架，该支架能够复现新生儿心脏ECM的组成复杂性和各向异性结构。hiPSC-CFs作为一种无限的细胞来源，可以生产心脏特异性的ECM，同时避免了植入增殖性CFs可能引发的心律失常风险，也不受新生儿和胎儿人类心脏ECM相关的伦理限制，且能够实现可扩展、可重复的生产，批次间变异性极小。

本研究旨在评估各向异性和心脏特异性ECM对hiPSC-CMs成熟的影响。研究人员比较了来自hiPSC-CF、人心室原代心脏成纤维细胞（pri-CF）和人真皮成纤维细胞（hDF）的ECM组成，发现hiPSC-CF-ECM能够显著促进hiPSC-CMs的结构和功能成熟。hiPSC-CMs在这些ECM支架上培养时，能够响应ECM纳米纤维提供的结构线索，实现各向异性的排列和结构成熟。通过批量RNA测序（RNAseq）数据，研究人员深入探究了hiPSC-CMs在hiPSC-CF-ECM上培养时功能成熟的分子机制，并结合电生理学和数字图像校正（DIC）应变测量分析进行了验证。最后，研究团队在大鼠MI模型中证明了hiPSC-CF-ECM单独应用在心脏修复中的潜力。

本研究发表在国际知名期刊《Bioactive Materials》上，由德克萨斯A&M大学生生物医学工程系的Dhavan Sharma、Wenkai Jia、Alvis Chiu、Hee Jae Jang、Vladislav Leonov、Zhishi Chen、Brandon Zhao、Weijia Luo、Hutomo Tanoto、Jianhua Zhang、Alexey V. Glukhov、Yong Yang、Yuxiao Zhou、Jiang Chang、Timothy J. Kamp和Feng Zhao共同完成。

主要关键技术方法

研究首先通过hiPSC定向分化获得心肌细胞（hiPSC-CMs）和心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs），采用微沟槽聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底培养细胞片层并经去细胞化处理制备各向异性ECM支架。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）、场发射扫描电镜（FE-SEM）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）等技术系统评估了ECM的成分与结构。hiPSC-CMs在支架上培养后，利用免疫荧光染色、RNA测序（RNA-seq）、光学映射电生理分析及数字图像相关（DIC）应变测量等技术分析其成熟度与功能。动物实验采用大鼠心肌梗死模型，通过超声心动图评估心脏功能修复效果。

研究结果

3.1. 心脏特异性和非心脏ECM支架的制备

通过在微沟槽PDMS基底上培养高度排列的细胞片层两周并进行去细胞化，成功制备了心脏特异性（hiPSC-CF-ECM、pri-CF-ECM）和非心脏（hDF-ECM）的ECM支架。免疫荧光染色显示ECM中胶原I、层粘连蛋白和纤连蛋白呈现高度排列的纳米纤维结构，Verhoeff Van Gieson染色显示弹性纤维的组织结构。所有ECM支架厚度介于11-14μm，其中hiPSC-CF-ECM的纤维束直径（196.62±46.52nm）显著小于pri-CF-ECM（396.62±99.21nm）和hDF-ECM（104.59±28.48nm）。

3.2. ECM支架的结构和组成评价

定量分析显示，hiPSC-CF-ECM和pri-CF-ECM含有更高水平的不溶性胶原、可溶性胶原和弹性蛋白，而hDF-ECM的糖胺聚糖（GAG）含量最高。生长因子检测表明，hiPSC-CF-ECM中血管内皮生长因子（VEGF）和内皮素I浓度最高，pri-CF-ECM中成纤维细胞生长因子（FGF）含量较高。LC-MS分析鉴定出近700种肽段，hiPSC-CF-ECM中心脏特异性纤维胶原（如COL1、COL5）、非纤维胶原（如COL12、COL14）和基质细胞蛋白（如POSTN、TNC）表达丰富，与天然心脏ECM组成高度相似。

3.3. hiPSC-CMs在ECM支架上的结构和功能成熟评估

hiPSC-CMs在所有ECM支架上均沿ECM纤维各向异性排列，并表现出成熟的肌动蛋白（F-actin）、肌节α-辅肌动蛋白（SAA）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）和连接蛋白43（Cx43）表达。RNA-seq分析显示，与胶原I对照组相比，hiPSC-CMs在心脏ECM支架上培养后差异表达基因（DEGs）显著富集于心脏收缩、肌节组装、能量代谢等通路，其中hiPSC-CF-ECM组成熟相关基因上调最为明显。基因本体（GO）分析进一步证实，hiPSC-CF-ECM可特异性激活肌球蛋白结合、Z盘形成、心脏处理等生物学过程。

3.4. hiPSC-CMs的收缩特性

DIC应变分析显示，各组ECM支架上的hiPSC-CMs在最大主应变和搏动频率上无显著差异，但hiPSC-CF-ECM组肌节长度（通过SAA染色测量）显著长于其他组（p<0.001），表明其收缩结构更为成熟。

3.5. hiPSC-CMs的电生理特性

光学映射分析显示，所有ECM支架上的hiPSC-CMs单层均表现出自发动作电位，但胶原I组搏动频率较快。在1Hz电刺激下，hiPSC-CF-ECM组纵向传导速度（CV_L）显著高于胶原I组（31.5±3.8cm/s vs. 21.6±0.6cm/s），且各向异性比率（AR）在hiPSC-CF-ECM组（1.41±0.2）显著大于1（p=0.014），表明其各向异性传导能力增强。

3.6. hiPSC-CF-ECM在大鼠MI模型中的修复效果

在大鼠MI模型中植入hiPSC-CF-ECM补片后，心脏功能显著改善：射血分数（EF）提高，左心室收缩末期内径（LVID;s）和舒张末期内径（LVID;d）减小，整体纵向应变（GLS）增强，等容舒张时间（IVRT）和二尖瓣压力半衰期（PHT）改善，表明hiPSC-CF-ECM促进了正向心脏重塑。

结论与讨论

本研究成功开发了一种基于hiPSC-CFs的完全生物源性、各向异性心脏特异性ECM支架，其具有复杂的生化组成（富含心脏特异性胶原、生长因子和基质细胞蛋白）和仿生结构。该支架显著促进了hiPSC-CMs的结构排列、收缩蛋白表达、电生理成熟和基因表达谱向成年心肌细胞特征转变。机制上，hiPSC-CF-ECM通过提供关键的生化和生物物理信号（如整合素激活、生长因子释放、各向异性拓扑引导）恢复了细胞-ECM相互作用，从而驱动心肌细胞成熟。动物实验进一步证实了hiPSC-CF-ECM单独应用可有效改善心肌梗死后的心脏功能并抑制不良重塑。

这一创新性“自下而上”的组织工程策略不仅规避了传统ECM来源的伦理和批次变异问题，还为心脏再生医学提供了可个性化定制、功能优越的生物材料平台。未来研究可进一步探索hiPSC-CF-ECM与血管化细胞或免疫调节成分的组合策略，以加速其临床转化应用。