靶向衰老滑膜巨噬细胞重塑：pCQ/SOD纳米颗粒治疗骨关节炎的新策略

本研究针对骨关节炎(OA)中免疫衰老机制不清和治疗策略缺乏的难题，开发了一种负载超氧化物歧化酶(SOD)的氯喹聚合物纳米颗粒(pCQ/SOD)，通过单细胞测序和免疫荧光技术发现OA滑膜中衰老巨噬细胞显著增加且功能衰退，该纳米颗粒能高效靶向递送SOD至巨噬细胞，通过抑制p53信号通路和线粒体外膜通透化(MOMP)，增强STAT3/ADAM17/MerTK介导的胞葬作用，重编程M1向M2极化，成功缓解创伤性和衰老性OA，为OA治疗提供了新型衰老治疗策略。

　　

骨关节炎作为一种与年龄密切相关的退行性关节疾病，全球患者人数已超过6.54亿，其特征包括不可逆的软骨退化、滑膜炎和软骨下骨重塑。目前基于材料、细胞或药物的治疗方法均无法完全恢复透明软骨的结构和功能，也不能有效延缓疾病进展。在OA早期阶段，免疫稳态失衡是关键病理变化之一，其中滑膜巨噬细胞在OA发生发展中起着至关重要的作用。M1型巨噬细胞分泌白细胞介素1(IL1)、IL6、肿瘤坏死因子-α(TNFα)等促炎细胞因子，放大炎症反应并加剧软骨侵蚀，而M2型巨噬细胞则通过分泌IL10等细胞因子发挥抗炎和组织修复作用。然而，调控M1/M2极化的策略仍面临效率不佳的挑战。

免疫衰老与衰老相关疾病密切相关，其特征包括炎症衰老、新抗原反应受损、应激反应和衰老细胞积累。免疫衰老的标志之一是促炎细胞因子上调的慢性低度炎症状态，这也是OA的典型特征。研究表明巨噬细胞衰老表现为Cdkn2a和Cdkn1b等高表达，通过分泌衰老相关分泌表型(SASP)增强炎症反应，这意味着衰老巨噬细胞倾向于表现为促炎表型。然而，巨噬细胞衰老与OA之间的关系仍不清楚，精确重塑衰老免疫细胞仍是临床面临的挑战。

OA进展与活性氧(ROS)相关，ROS由活化巨噬细胞或炎症条件下的软骨细胞产生，可导致软骨细胞衰老和巨噬细胞p21表达增强，表明ROS是OA微环境中的衰老诱导剂。因此，降低巨噬细胞中ROS水平有望挽救巨噬细胞衰老。超氧化物歧化酶(SOD)长期以来被用作ROS清除剂，能够通过级联反应清除超氧阴离子和过氧化氢，从而保护氧化损伤并延缓机体衰老。SOD1缺失会导致p16、p21和SASP水平升高，表明SOD具有抗炎和抗衰老特性。然而，SOD作为一种不稳定且膜不透性的蛋白质，无法直接进入巨噬细胞清除细胞内ROS。因此，细胞内蛋白质递送系统对于通过SOD缓解巨噬细胞衰老治疗OA具有重要意义。

对于细胞内蛋白质递送，研究人员先前的工作中已经提出了多种构建聚合物载体的策略。具有适当正电荷和疏水性平衡的聚合物有望实现高效的细胞内蛋白质递送。氯喹(CQ)作为一种抗疟剂，结构上以可质子化胺基和疏水性喹啉环为特征，可作为递送载体的构建模块。此外，作为一种生物活性物质，CQ与衰老和炎症密切相关，因为低剂量CQ已被证明可延长老年大鼠的寿命并抑制炎症。CQ的使用还能显著降低β-半乳糖苷酶的诱导，表明CQ具有抗衰老特性。此外，CQ是通过抑制IL-1、IFNα和TNF等促炎细胞因子产生来治疗类风湿关节炎的DMARDs之一，表明CQ具有抗炎特性。机制上，先前的研究发现羟氯喹是STAT3的灭活剂，而STAT3是诱导衰老发生和巨噬细胞胞葬作用受损的关键因子。因此，CQ是一种可行的用于功能性蛋白质细胞内递送的抗衰老和抗炎材料。

本研究首先通过GEO数据集的单细胞测序分析和免疫共荧光技术鉴定了OA中的巨噬细胞衰老。研究发现与对照组相比，OA滑膜巨噬细胞中p53、Cdkn1b、Rb1和β-半乳糖苷酶等衰老相关生物标志物表达显著上调，而抗衰老基因Lmnb1表达降低。重要的是，OA衰老巨噬细胞表现出增强的M1极化、增加的线粒体损伤和受损的胞葬作用，这些都对OA恶化至关重要。基于此，重塑OA中的巨噬细胞衰老有望成为一种新的治疗策略。研究人员进一步合成了含CQ的聚合物(pCQ)作为载体，实现SOD(pCQ/SOD)高效细胞内递送到巨噬细胞中并缓解巨噬细胞衰老。机制上，研究发现pCQ/SOD不仅能作为ROS清除剂抑制BAX依赖性线粒体外膜通透化(MOMP)，还能通过STAT3/ADAM17/MerTK信号增强巨噬细胞胞葬作用，这两者都有利于局部微环境中巨噬细胞衰老的挽救。令人惊讶的是，这种制备的衰老治疗纳米颗粒不仅能通过抑制p53和细胞衰老信号通路的巨噬细胞衰老来重编程M1向M2再极化，还能通过关节内注射缓解创伤诱导和衰老诱导的OA。本研究开发的基于pCQ的纳米颗粒证明了靶向巨噬细胞衰老治疗OA的功效和重要性。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合合成氯喹聚合物载体；利用动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)表征纳米颗粒；建立D-半乳糖(D-gal)和过氧化氢(H₂O₂)诱导的巨噬细胞衰老模型；通过单细胞RNA测序分析衰老相关基因表达；使用激光共聚焦显微镜评估细胞内蛋白递送效率；通过关节内注射评估纳米颗粒的靶向性和治疗效果；采用免疫组化和免疫荧光分析组织样本；使用流式细胞术分析巨噬细胞极化状态；通过Western blot分析信号通路蛋白表达。人类滑膜样本来自7名需要全膝关节置换术的OA患者和3名无OA病史的关节修复患者。

2.1. OA滑膜巨噬细胞表现出增加的衰老表型

通过对人OA患者和对照组滑膜巨噬细胞中典型衰老生物标志物p53的检测，免疫共荧光显示OA中衰老滑膜巨噬细胞相比对照组显著增加。在小鼠DMM手术诱导的OA模型中也发现OA组CD68阳性滑膜巨噬细胞中p53表达显著增强。单细胞测序分析进一步显示，与假手术组相比，ACLR-OA组巨噬细胞中Cdkn1a(p21)、Trp53(p53)、Rb1和Glb1(β-半乳糖苷酶)等一系列衰老生物标志物表达增加，而Lmnb1表达降低。功能分析表明，衰老巨噬细胞中SASP相关基因如Csf2ra、Tnfrsf1a、Tnfrsf11a、Tnfrsf1b、Igfbp7、S100a6显著增加，M1相关基因TLR4增加而M2相关基因CD163减少，线粒体相关基因BAX、BAK1、Fis1和Opa1表达增加，胞葬作用相关基因CD47、Jak1、Stat3和Adam17显著增加。

2.2. 构建pCQ用于SOD的巨噬细胞内递送

研究人员合成了一种新型阳离子共聚物pCQ，通过RAFT聚合从2-(二乙氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DEAEMA)和含氯喹单体(MACQ)制备。pCQ/EGFP复合物在Raw264.7细胞中的平均荧光强度显著增加，pCQ/SOD-Cy5.5也显示出比单独SOD-Cy5.5更强的细胞摄取。纳米颗粒表征显示pCQ/EGFP和pCQ/SOD的流体动力学直径分别约为350nm和140nm，zeta电位分别为8.3mV和9.9mV。体内实验表明，SOD-Cy5.5能有效递送到滑膜中CD68阳性巨噬细胞中，而在软骨中几乎未发现，表明pCQ/SOD对滑膜巨噬细胞而非软骨细胞具有优异的靶向递送功效。

2.3. pCQ/SOD抑制巨噬细胞衰老并重编程M1向M2极化

通过D-半乳糖诱导巨噬细胞衰老模型，发现pCQ/SOD能显著抑制巨噬细胞的衰老表型，β-半乳糖苷酶染色和p53 mRNA水平显示效果优于其他对照组。衰老巨噬细胞倾向于极化为M1状态而非M2状态，而pCQ/SOD处理能有效限制衰老巨噬细胞的M1极化并增强M2极化，流式细胞术显示pCQ/SOD处理显著减少CD86阳性细胞数量并增加CD206阳性细胞。RNA测序结果显示，pCQ/SOD处理通过p53信号通路和细胞衰老通路显著影响巨噬细胞，衰老相关基因(Ccnb2、Serpine1、Ccnd1、Ccne2、Chek1、Cdk1)大大降低，而抗衰老基因(Gadd45b和Mdm2)显著增加。

2.4. pCQ/SOD抑制MOMP并增强针对衰老的巨噬细胞胞葬作用

研究发现pCQ/SOD能降低BAX表达，作为ROS清除剂表现出比游离pCQ或SOD更强的ROS清除活性。pCQ/SOD还能挽救衰老引起的线粒体膜电位(mΔψ)显著降低，减少JC-1染色中的单体(绿色)并增加聚集体(红色)，表明pCQ/SOD减少了衰老巨噬细胞中的MOMP。此外，pCQ/SOD显著上调衰老巨噬细胞中胞葬作用相关受体MerTK的转录水平。共培养实验表明，pCQ或pCQ/SOD处理能显著增强衰老巨噬细胞的胞葬作用。机制上，pCQ/SOD通过STAT3/ADAM17/MerTK信号增加巨噬细胞胞葬作用，CQ、pCQ或pCQ/SOD处理显著降低p-STAT3和ADAM17蛋白水平。

2.5. 关节内注射pCQ/SOD缓解DMM诱导和ACLT诱导的OA

体内评估显示，pCQ/SOD治疗能有效减少软骨侵蚀，表现为更多的番红O面积、更少的MMP13阳性细胞和更多的聚集蛋白聚糖(ACAN)阳性细胞，治疗效果优于pCQ或SOD处理。在ACLT诱导的OA模型中也观察到一致的结果，表明这种衰老治疗策略在DMM和ACLT诱导的OA中均有效。关节内注射pCQ/SOD导致滑膜中iNOS阳性细胞减少和CD206阳性细胞增加，明显展示了pCQ/SOD出色的免疫调节能力。

2.6. pCQ/SOD重塑滑膜衰老巨噬细胞有助于缓解衰老诱导的OA症状

在18月龄老年小鼠中每周关节内注射pCQ/SOD持续6周，发现pCQ/SOD治疗能显著抑制滑膜巨噬细胞中p53表达，并限制滑膜中的巨噬细胞浸润。老年小鼠表现出比年轻小鼠更严重的软骨侵蚀，更多的iNOS阳性细胞和更少的CD206阳性细胞，表明巨噬细胞衰老自发导致增强的M2向M1极化，与老年小鼠OA症状加剧一致。pCQ、SOD或pCQ/SOD处理的老年小鼠均表现出不同程度的老化诱导OA症状缓解，其中pCQ/SOD显示最佳效果。

研究表明，OA是一种最常见的与衰老相关的疾病，具有复杂的免疫发病机制。滑膜巨噬细胞是OA病理中最涉及的免疫细胞，长期以来被证明通过极化为不同状态发挥作用。然而，在OA复杂的微环境中，滑膜巨噬细胞的聚类及相关功能亟待更深入的研究，远不止M1/M2巨噬细胞。值得注意的是，衰老细胞在OA病理中起着关键作用，包括衰老软骨细胞和衰老成纤维细胞，而免疫衰老在各种衰老相关疾病中起着重要作用，在OA中却很少受到关注。本研究首次通过单细胞测序分析和OA样本的免疫荧光鉴定了OA滑膜中的巨噬细胞衰老。OA衰老巨噬细胞表现出增强的SASP分泌、增加的M1极化、线粒体损伤和受损的胞葬作用，这些导致OA进展。因此，研究人员提出了一种新型含CQ聚合物用于SOD的细胞内递送，以靶向巨噬细胞衰老及相关功能衰退。制备的pCQ/SOD纳米颗粒作为一种有效的ROS清除试剂，通过SOD抑制氧化应激诱导的MOMP，并通过pCQ通过STAT3/ADAM17/MerTK通路促进巨噬细胞胞葬作用。这种衰老治疗纳米颗粒策略有效逆转了滑膜巨噬细胞的衰老，进一步成功调节了M1向M2再极化。值得注意的是，pCQ/SOD的M2诱导不会降低巨噬细胞的胞葬作用，但会增强胞葬能力，这与先前的研究一致。最终，这种免疫衰老靶向策略缓解了创伤性和衰老性OA的症状。

总之，该研究不仅揭示了滑膜巨噬细胞衰老在OA进展中的作用，而且通过干预免疫衰老建立了一种有效且有前景的OA治疗方法。相信巨噬细胞靶向治疗由于滑膜的物理特性和巨噬细胞的吞噬作用而具有更精确的靶向能力，而软骨细胞靶向治疗则需要通过材料或药物疗法有效穿透软骨。重要的是，该研究揭示了对OA巨噬细胞的不足理解，并为早期OA中免疫细胞的精确功能调控开辟了新途径。