通过快速实验室进化技术（基因组重排）对本土酵母菌株 Saccharomyces cerevisiae 进行改良

《Bioscience Reports》：Improvement of autochthonous Saccharomyces cerevisiae by rapid laboratory evolution technique of genome shuffling

本研究通过分子生物学和FT-IR光谱技术鉴定了印度卡纳塔克地区自生酿酒酵母RHTD4和RHTD10，并利用基因组重排技术改良其糖耐受性和酒精合成能力。结果表明，经三轮基因组重排的GS3菌株在30%糖浓度下生长良好，酒精产量达10.14%，显著优于野生株（7.11%）。

　　在葡萄酒酿造过程中，酵母菌株的选择对最终产品的风味、香气以及整体质量起着至关重要的作用。Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）作为主要的发酵微生物，广泛应用于葡萄酒生产中。然而，尽管其在工业上的应用历史悠久，但使用本地（indigenous）的S. cerevisiae菌株进行发酵的实践却相对较少。本地酵母通常更适应特定的地理环境和气候条件，能够更好地保留本地水果的风味特征，从而为生产具有地域特色的葡萄酒提供独特的价值。因此，研究和应用本地酵母菌株具有重要的现实意义。本研究旨在通过分子鉴定、FT-IR分析以及基因组重排（genome shuffling）技术，对本地S. cerevisiae菌株进行改良，以提升其在葡萄酒发酵中的性能，特别是在糖耐受性和酒精产量方面。

### 本地酵母的鉴定与表征

为了准确识别和表征本地酵母菌株，研究人员采用了多种技术手段。首先，通过28S rRNA基因的D1/D2区域测序，对酵母菌株进行了分子层面的鉴定。这一方法能够有效区分不同酵母种类，并提供其遗传背景的信息。随后，结合傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，进一步确认了酵母菌株的身份。FT-IR是一种非破坏性的高通量分析方法，通过检测分子在红外光谱中的吸收特征，能够快速、可靠地识别不同酵母菌株的化学组成和结构。这些分析不仅帮助研究人员确认了所选菌株的分类地位，还揭示了其在不同环境条件下的生理特性。

在对本地S. cerevisiae菌株的表型评估中，研究人员考察了其对温度、乙醇、糖分和二氧化硫的耐受能力。这些参数对于葡萄酒发酵至关重要，因为酵母必须在多种环境压力下保持活性，才能有效转化糖分生成酒精。研究结果显示，RHTD10菌株在温度耐受性方面表现出良好的适应能力，尤其在18℃的条件下生长最为旺盛。这一温度有助于保持水果的果香和挥发性香气成分，从而对葡萄酒的风味产生积极影响。此外，RHTD10菌株在二氧化硫耐受性方面也优于其他菌株，这一特性对于现代葡萄酒酿造尤为重要，因为二氧化硫常用于抑制有害微生物的生长，从而保证发酵过程的稳定性。

### 基因组重排技术的引入

为了进一步提升本地S. cerevisiae菌株的性能，研究人员引入了基因组重排技术。该技术是一种基于多亲本细胞融合和全基因组重组的创新方法，能够有效整合不同菌株的优良性状。与传统的突变筛选方法相比，基因组重排技术具有更高的效率和灵活性，因为它可以快速将多个有益的基因组合在一起，而无需依赖详细的遗传信息。这种技术特别适用于那些需要在短时间内提升特定性状的工业微生物改良项目。

在本研究中，研究人员对RHTD10菌株进行了多轮基因组重排实验。通过递归融合和再生，每一轮实验都会生成新的菌株，这些菌株在糖耐受性和酒精产量方面表现出不同程度的提升。实验结果显示，经过三轮基因组重排后，GS3菌株的糖耐受性显著增强，能够承受高达30%的糖浓度。同时，其酒精产量也达到了10.14 ± 0.21%，远高于原始菌株的7.11 ± 0.22%。这一结果表明，基因组重排技术能够有效地提升酵母菌株的发酵性能，使其在高糖环境下仍能保持较高的活性和代谢效率。

### 基因组重排的实验流程

基因组重排实验的流程主要包括以下几个步骤：首先，通过化学诱变剂乙基甲磺酸（EMS）和物理诱变方法（如紫外线照射）对原始菌株进行诱变处理，以生成具有不同遗传特征的突变株。然后，将这些突变株进行原生质体融合，这一过程需要将细胞壁去除，使细胞成为原生质体（protoplasts），以便于融合。原生质体的融合通常在含有聚乙二醇（PEG）的培养基中进行，PEG能够促进细胞膜的融合，从而实现基因的重组。融合后的细胞需要在特定的再生培养基中培养，以恢复其正常的细胞结构和功能。研究人员通过相衬显微镜观察原生质体的融合过程，并记录不同阶段的菌落形成和再生频率。

在每一轮基因组重排后，研究人员对新生成的菌株进行了糖耐受性和酒精产量的评估。通过在合成葡萄汁培养基中进行发酵实验，研究人员测量了不同菌株在不同糖浓度下的生长情况，并通过气相色谱-火焰离子检测（GC-FID）分析酒精的产量。结果显示，随着基因组重排轮次的增加，菌株的糖耐受性逐渐提升，而酒精产量在第三轮达到峰值后开始下降。这一趋势表明，基因组重排技术虽然能够有效提升酵母菌株的性能，但需要在适当的轮次下进行，以避免过度突变导致性能下降。

### 基因组重排的优势与应用前景

与传统的酵母菌株改良方法相比，基因组重排技术具有显著的优势。首先，它能够快速整合多个有益的性状，从而在较短的时间内获得性能优越的菌株。其次，该技术不需要复杂的遗传分析，因此操作简便，成本较低。此外，基因组重排技术不依赖于转基因手段，因此在食品和饮料行业中的应用更为安全和可行。这些优势使得基因组重排成为一种极具潜力的微生物改良技术。

然而，尽管基因组重排技术具有诸多优点，它仍然是一种相对新颖的方法，因此在实际应用中仍需进一步探索和完善。例如，如何优化原生质体的融合效率，如何提高菌株的再生率，以及如何在不同轮次中保持菌株的遗传稳定性等问题，都是未来研究需要关注的重点。此外，研究人员还指出，基因组重排技术可以与其他先进的微生物改良方法（如实验进化、CRISPR基因编辑和系统代谢工程）相结合，以进一步提升菌株的性能。

### 合成葡萄汁的制备与发酵实验

为了确保实验的可重复性和可控性，研究人员使用了合成葡萄汁作为发酵基质。合成葡萄汁的成分经过精确配制，包括葡萄糖和果糖作为碳源和能量来源，以及多种有机酸、无机盐和抗氧化剂等。这些成分的加入不仅模拟了自然葡萄汁的复杂组成，还能够提供稳定的发酵环境，便于评估酵母菌株的性能。

在发酵实验中，研究人员通过GC-FID分析酒精的产量，并通过OD值（光密度）评估酵母在不同糖浓度下的生长情况。实验结果显示，经过三轮基因组重排的GS3菌株在糖浓度为30%时，其OD值显著高于原始菌株和其他轮次的菌株。这表明GS3菌株在高糖环境下的生长能力得到了明显提升。同时，酒精产量在第三轮实验中达到了最高水平，显示出该菌株在发酵过程中的高效代谢能力。

### 基因组重排对酵母性能的提升

基因组重排技术不仅能够提升酵母菌株的糖耐受性，还能够增强其酒精产量。这一结果对于葡萄酒酿造具有重要意义，因为高糖环境往往会对酵母的生长和代谢产生抑制作用，而高酒精含量则可能影响葡萄酒的口感和风味。通过基因组重排技术，研究人员成功地克服了这些挑战，使GS3菌株能够在高糖条件下保持较高的活性，并生成更多的酒精。

此外，基因组重排还能够改善酵母的其他生理特性，如温度耐受性和二氧化硫耐受性。这些特性对于葡萄酒酿造的稳定性至关重要，因为温度波动和二氧化硫的使用都会对发酵过程产生影响。研究人员通过实验发现，GS3菌株在这些方面表现出优于原始菌株和早期轮次菌株的性能，这表明基因组重排技术能够全面提升酵母菌株的适应能力。

### 基因组重排的应用价值

基因组重排技术在食品和饮料行业的应用前景广阔。它不仅可以用于葡萄酒酵母的改良，还可以应用于其他发酵食品的生产，如啤酒、酱油和面包等。通过这一技术，研究人员能够快速筛选出具有优良性能的菌株，并将其应用于实际生产中，从而提高产品的质量和稳定性。此外，该技术还能够减少对传统商业酵母的依赖，促进本地酵母的利用，这不仅有助于保护生物多样性，还能够推动区域特色产品的开发。

在本研究中，基因组重排技术的应用为本地S. cerevisiae菌株的改良提供了新的思路和方法。通过多轮实验，研究人员成功地提升了菌株的糖耐受性和酒精产量，使其在高糖环境下仍能保持较高的发酵效率。这一成果不仅为葡萄酒酿造提供了更优的菌株选择，也为其他发酵工业的应用提供了借鉴。

### 本地酵母的潜力与挑战

尽管本地酵母在某些方面表现出优异的性能，但在实际应用中仍面临一定的挑战。例如，本地酵母的竞争力通常不如商业酵母，这使得其在自然发酵过程中难以占据主导地位。因此，通过基因组重排技术对本地酵母进行改良，不仅能够提升其性能，还能够增强其在发酵过程中的竞争力，从而实现更高效的发酵效果。

此外，本地酵母的遗传多样性也是其优势之一。通过基因组重排技术，研究人员能够将不同本地酵母的优良性状整合在一起，从而获得具有更广泛适应能力的菌株。这一过程不仅能够保留本地酵母的天然特性，还能够通过人工筛选和优化，使其更符合现代酿造的需求。

### 未来展望

随着基因组重排技术的不断发展和完善，其在微生物改良领域的应用将更加广泛。未来，研究人员可以进一步探索该技术在不同环境条件下的适用性，并结合其他先进的技术手段，如基因编辑和系统代谢工程，以实现更精确的菌株改良。此外，基因组重排技术还可以与其他生物技术相结合，如合成生物学和代谢组学，以更全面地理解酵母的代谢机制，并优化其性能。

总的来说，基因组重排技术为本地S. cerevisiae菌株的改良提供了一种高效、经济且安全的方法。通过这一技术，研究人员能够快速提升酵母的性能，使其在高糖和高酒精环境下仍能保持良好的发酵能力。这不仅有助于提高葡萄酒的质量和风味，还为其他发酵食品的生产提供了新的可能性。未来，随着技术的进一步发展，基因组重排有望成为微生物改良领域的重要工具，为食品工业带来更多的创新和突破。