综述：盘基网柄菌溶酶体酶加工与运输的机制研究

本综述系统总结了盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）作为模式生物在溶酶体酶合成、翻译后修饰（如M6P-OMe、M6S）、运输途径（包括常规分泌与非常规分泌）及功能研究中的最新进展，强调了其在人类溶酶体贮积症（LSDs）等疾病建模中的价值，为相关靶点（如CI-MPR、Sortilin）和通路机制研究提供了重要见解。

　　

模式真核生物盘基网柄菌

盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）是一种广泛分布于温带落叶林腐殖质中的单细胞真核微生物，自1935年发现以来，已成为研究趋化性、细胞黏附、分化和多细胞发育等进化保守过程的经典模型。其基因组小且为单倍体，编码大量人类蛋白同源物，尤其是与疾病相关的基因。得益于低廉的培养成本和丰富的遗传资源（如dictyBase数据库和Dicty Stock Center），该生物在宿主-病原体相互作用、内吞机制、自噬及社会行为进化等领域应用广泛。

盘基网柄菌的生命周期包括单细胞和多细胞阶段：营养充足时以单细胞形式增殖，饥饿时启动24小时的多细胞发育程序，形成聚集态、蛞蝓体和最终的子实体。20世纪70年代，研究发现其具有独特的溶酶体系统，后续工作加速了对溶酶体酶合成、修饰、运输和活性的解析。尽管早期研究提示溶酶体系统存在异质性（如不同功能类别的溶酶体），但后续证据表明这些机制实为一个互联的整体系统。与人类细胞类似，盘基网柄菌的溶酶体酶通过翻译后修饰靶向成熟内体（巨胞饮体或吞噬体）或细胞外空间。蛋白质组学分析显示，其溶酶体酶从盘基网柄菌到哺乳动物具有高度保守性。

基因敲除和敲降技术在该模型中已成熟应用，可模拟人类溶酶体贮积症（LSDs）。此外，研究溶酶体酶运输和活性的实验方案也十分完善，这重新确立了盘基网柄菌作为研究保守溶酶体酶功能及运输调控机制的优势模型地位。

溶酶体酶在盘基网柄菌中的合成与修饰

溶酶体酶在粗面内质网（RER）中合成后，经历糖基化修饰：寡糖链通过氮连接（天冬酰胺）或氧连接（丝氨酸）添加。N-连接聚糖主要由甘露糖组成，并通过聚N-乙酰葡糖胺锚定在酶上。葡萄糖苷酶I和II切除末端葡萄糖分子，触发酶向高尔基体转运。在高尔基体内，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶（Gpt1）催化聚糖磷酸化，将GlcNAc-1-P添加到甘露糖末端。随后，未知的“ uncovering enzyme”切除GlcNAc，并由S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基transferase添加甲基，形成甘露糖-6-磷酸-甲酯（M6P-OMe）。

M6P-OMe修饰被认为可定位酶至溶酶体，但确凿证据尚缺。该修饰可结合人类阳离子非依赖型M6P受体（CI-MPR），而盘基网柄菌基因组编码CI-MPR同源物而非CD-MPR同源物，支持这一靶向机制。部分酶还存在丝氨酸连接的GlcNAc-1-P修饰，可能由同一磷酸转移酶催化，这些酶定位于内体-溶酶体途径的囊泡，但不与M6P-OMe修饰酶共定位，提示存在不同的靶向机制。

另一种修饰是甘露糖-6-硫酸盐（M6S）。硫酸化最初被认为参与酶的加工和分选，但后来证明非必需，可能参与成熟酶的分泌。缺失硫酸转移酶Kil1的细胞无法消化吞噬的细菌，但溶酶体生理基本正常，表明硫酸化修饰可能特异作用于细菌消化相关的酶，并定位于 distinct pre-lysosomal compartments。硫酸化在发育过程中减少，提示其可能通过吞噬作用靶向早期食物颗粒消化。M6S也可被CI-MPR识别，但竞争性低于M6P-OMe。

盘基网柄菌中溶酶体酶的运输

翻译后修饰与蛋白加工的作用

溶酶体酶以内吞区室的不同速率运输，且前体形式的蛋白酶水解加工成熟对其高效运输至关重要。不同酶在吞噬体成熟的不同时间点被递送，而抑制蛋白酶加工会导致前体形式过度分泌。以α-甘露糖苷酶为例，其前体和成熟形式均在生长和饥饿期分泌，但前体糖基化修饰更广泛。两种形式均具酶活，支持其胞外功能。前体的蛋白酶加工为其从高尔基体至溶酶体运输所必需。饥饿细胞中，前体直接从前溶酶体器释放，而成熟形式先转运至溶酶体后再分泌，表明至少存在两个酶池，且多途径调控运输与分泌。

溶酶体酶的调控分泌

传统认为溶酶体是终端区室，但新证据表明溶酶体胞吐是所有细胞类型的特征，参与质膜修复、细胞外基质（ECM）重塑和细胞间通讯。盘基网柄菌细胞主动分泌溶酶体酶，这一过程需能量，非细胞裂解或被动扩散所致。分泌动力学区别于不可消化物质的排出，提示其为生命周期的重要方面。近期研究显示，WASH依赖性酶回收后的溶酶体胞吐可占分泌水解酶的50%。

1980-90年代的研究表明，盘基网柄菌在生长期间分泌大量溶酶体酶，但分泌量受培养基成分影响。例如，β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和α-甘露糖苷酶在静止期分泌，而β-半乳糖苷酶-2则不分泌。饥饿时，多种酶以相近速率快速分泌，可能源自同一溶酶体囊泡，但并非所有酶都如此（如酸性磷酸酶）。此外，酸性磷酸酶的三种不同形式在发育不同阶段分泌，α-L-岩藻糖苷酶在聚集期而非生长期分泌，表明分泌受生命周期阶段特异性调控。

盘基网柄菌中溶酶体酶分泌的调控机制

常规与非常规分泌途径

真核细胞中，蛋白质通过常规或非常规途径释放。常规分泌中，高尔基体中的蛋白被包装成分泌囊泡，与质膜融合后释放；含分泌信号序列的蛋白通常经此途径分泌。无信号序列的蛋白通过非常规途径释放，如与自噬（分泌性自噬）或溶酶体-质膜融合（溶酶体胞吐）相关的途径。新证据表明，含信号序列的蛋白也可通过非常规机制分泌。

在分泌性自噬中，自噬体与多泡体融合形成amphisomes，最终与质膜融合释放内容物。该途径涉及自噬蛋白、GRASP、ESCRT和SNARE蛋白。在人类细胞中，这些机制在线粒体清除、病毒释放、质膜修复和ECM重塑中起重要作用。溶酶体胞吐通过直接融合实现，需要马达和细胞骨架蛋白参与。盘基网柄菌的溶酶体源自巨胞饮体和吞噬体，逐步获得V-ATPase、水解酶和生化标志物。

盘基网柄菌中溶酶体酶的非常规分泌

溶酶体抑制剂氯化铵和氯喹增加溶酶体酶前体形式的分泌，减少其成熟加工。氯喹作用于高尔基体远端或前溶酶体区室，阻止正常分选；但氯化铵不刺激酸性磷酸酶的误分泌，支持酶定位不同囊泡的观点。近期研究表明，Cln5和CtsD通过非常规途径分泌，涉及糖基化、分泌信号序列、自噬蛋白、自噬体-溶酶体融合、微丝和溶酶体胞吐相关蛋白。但部分要求因酶而异（如Cln5需自噬体-溶酶体融合而CtsD不需），进一步支持多途径调控。

盘基网柄菌的遗传易操作性允许创建分泌缺陷突变体，揭示多个调控因子。例如，Rab超家族蛋白RabS和Rab7分别调控β-葡萄糖苷酶释放和α-甘露糖苷酶从分泌溶酶体至溶酶体的逆行运输。网格蛋白重链缺失影响前体酶胞内分选和某些成熟水解酶（如α-甘露糖苷酶）的分泌速率，但不影响其他（如酸性磷酸酶）。细胞内钙耗竭 disrupts 分泌途径。这些数据突显了调控网络的复杂性。

利用质谱研究盘基网柄菌中溶酶体酶的运输

质谱技术揭示了三种常用野生型菌株的分泌组，包括糖苷水解酶、脂肪酶、组织蛋白酶、各种半胱氨酸蛋白酶、Ppt1和多个Tpp1样蛋白等溶酶体酶。基因敲除对分泌组的影响也得到研究：例如，缺失cln3影响Cln5、CtsB、CtsD、Tpp1F、NagB、AplB、AplG和多种半胱氨酸蛋白酶的胞外量。Western blotting验证了Cln3对Cln5和CtsD释放的调控。cln3缺失还影响低渗应激和多细胞发育早期溶酶体酶的表达和活性。

类似地，Mfsd8缺失影响β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶1、Cln5、CtsB、CtsD、CtsZ和半胱氨酸蛋白酶的分泌，Western blotting确认其对Cln5和CtsD释放的调控。Mfsd8缺失还影响生长和发育早期溶酶体酶活性。这些工作表明Cln3和Mfsd8调控盘基网柄菌中溶酶体酶的活性和释放。

Sortilin在盘基网柄菌溶酶体酶运输中的作用

在人类细胞高尔基体中，CI-MPR和CD-MPR结合溶酶体酶上的M6P并将其运输至溶酶体。新发现的sortilin（SORT1）也将蛋白从高尔基体运输至内体、溶酶体、多泡体、质膜和分泌靶向囊泡。但其在溶酶体酶运输中的贡献尚不明确。SORT1的功能域为Vps10p隧道结构，其C末端尾将其定位至溶酶体，方式类似CI-MPR。SORT1涉及多个细胞通路，溶酶体分选仅为其功能的一小部分，但仍是重要受体，因其结合前颗粒蛋白（PGRN）并参与 prosaposin（PSAP）的运输。PGRN和PSAP被运至溶酶体切割成成熟形式，调控酶活性。盘基网柄菌基因组编码Sort1、Grn（PGRN同源物）和AplA（PSAP同源物），且Sort1定位内膜系统，近期研究提示其调控溶酶体酶运输。

结论

本综述总结了盘基网柄菌中溶酶体酶的合成、修饰、运输和命运，并指出未来可填补的知识空白。重点讨论了溶酶体酶分泌的广泛研究。溶酶体酶对其生命周期各阶段均 essential，生物信息学进步助力识别人类溶酶体贮积症相关酶同源物。虽有证据支持溶酶体酶的胞外存在，但其精确功能仍不明。推测多细胞发育早期的胞外蛋白酶活性可能降解细胞膜成分，覆盖基质以 facilitate 细胞迁移和发育，多数分泌缺陷突变体无法聚集支持这一观点。但α-D-半乳糖苷酶的分泌未发现胞外功能，表明需更多研究。例如，盘基网柄菌在发育早期分泌多种脂肪酶，人类中分泌脂肪酶水解酰化磷脂酰甘油为bis(monoacylglycero)phosphate（内体和溶酶体膜富集脂质）。此外，组织蛋白酶的过度分泌是癌细胞特征，通过减少细胞黏附、降解基底层和入侵ECM促进转移。 altered 蛋白分泌是多种人类疾病的标志，分泌酶有潜力作为临床生物标志物。总之，本综述凸显了盘基网柄菌在揭示溶酶体酶加工、运输和活性调控机制中的能力，为人类细胞研究提供信息。