综述：革兰氏阴性菌中乳铁蛋白受体的普遍性及其进化、功能与疫苗潜力

本综述系统总结了革兰氏阴性菌中宿主转铁蛋白（Tf）和乳铁蛋白（Lf）受体的发现历程、分布特征与进化起源。重点探讨了Tf受体（TbpA/TbpB）和Lf受体（LbpA/LbpB）在病原菌铁获取机制中的关键作用，及其作为疫苗靶点的潜力与挑战，为抗菌药物和疫苗研发提供了重要理论依据。

　　

Abstract

革兰氏阴性菌表面受体结合并从宿主糖蛋白转铁蛋白（Tf）或乳铁蛋白（Lf）中提取铁的发现，始于35年前在致病性奈瑟菌属中的研究，随后在人类和食品生产动物的其他病原体中也相继发现。这些细菌物种专门定植于哺乳动物宿主呼吸道或泌尿生殖道的黏膜表面，并依赖其宿主特异性的Tf和Lf受体获取铁以维持生存。细菌Tf受体的特异性被证明是由于对宿主Tf的选择压力所致，它们在同时存在于哺乳动物和鸟类中的细菌中的出现表明其起源于超过3.2亿年前。一旦Lf因基因复制事件在哺乳动物中出现，Lf受体便随后从Tf受体演化而来。对病原体的关注限制了我们对Tf和Lf受体在共生菌种中普遍性的理解，并引发了它们是否存在于其他细菌谱系中的疑问。由于Lf受体提供了次要的铁获取系统，并能提供对阳离子肽的保护，其在细菌谱系中的存在情况各不相同。

The prevalence of transferrin (Tf) and lactoferrin (Lf) receptors in pathogens and their utility as vaccine targets

宿主转铁蛋白（Tf）和乳铁蛋白（Lf）的表面受体在35多年前通过亲和捕获实验从引起脑膜炎和淋病的致病性奈瑟菌属中被鉴定和分离出来。Tf受体由两种蛋白质组成：较大的100 kDa蛋白Tf结合蛋白1（Tbp1，现称TbpA）和较小的80 kDa蛋白Tf结合蛋白2（Tbp2，现称TbpB）。这些受体对人类Tf和Lf具有特异性，并能在腹腔小鼠感染模型中支持感染，表明它们在体内条件下负责铁获取。分离受体蛋白并产生抗血清促进了从淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌克隆编码这些受体的基因，揭示TbpB是一种脂蛋白，而TbpA是一种完整的膜外蛋白，与TonB依赖的膜外蛋白同源，是铁获取所必需的。

亲和捕获方法为确定这些受体是否存在于其他人类病原体或食品生产动物的重要病原体中提供了机会。结果表明，奈瑟菌和莫拉菌菌株同时拥有Tf和Lf受体，而巴斯德菌科的成员仅拥有Tf受体。值得注意的是，在多杀性巴斯德杆菌的牛源菌株中，Tf受体是作为一个分子量低于TbpA的单一蛋白质被分离出来的。初步尝试定位Tf与细菌受体结合的区域显示，大多数细菌的Tf受体与Tf的C端叶结合，这是在血清正常生理条件下优先加载铁的区域。相比之下，来自牛莫拉菌的Tf受体结合C叶，而多杀性巴斯德杆菌的受体结合N叶。这种单组分Tf受体也在绵羊病原体卵形嗜组织菌中被鉴定出来，其表达要求更为复杂。由于Tf的N叶在哺乳动物宿主的正常生理条件下并非优先加载，一个明显的问题是反刍动物病原体在何种环境下需要这种单组分受体。反刍动物胃内容物的反流显然会在口腔中提供独特的生理条件，这可能是细菌从反刍动物谱系中分离出一种新型Tf受体TbpA2的原因。

来自奈瑟菌共生菌种的基因组序列显示，Tf和Lf受体仅存在于某些共生菌种中，这表明缺乏Tf和Lf受体的物种可能存在于微生物群落的不同区域，从其他来源获取铁。从小鼠粪便中分离的肌肉奈瑟菌缺乏Tf和Lf受体，可能仅仅是其分离位置的后果，并不表明存在于小鼠中的物种缺乏这些受体。这清楚地表明，应采用相对无偏的方法来分离拥有Tf和Lf受体的细菌。

定植于哺乳动物宿主（主要在上呼吸道）的细菌病原体拥有从宿主Tf获取铁所必需的表面受体，这强烈暗示Tf在黏膜表面可用，且细菌生存可能依赖这些蛋白质。这为疫苗公司评估它们开发针对脑膜炎奈瑟菌疫苗的潜力提供了充分理由。类似地，初步努力开始探索针对流感嗜血杆菌和随后卡他莫拉菌的Tf受体作为靶点的潜力。同样，在定植于食品生产动物的细菌中鉴定和表征Tf受体，推动了旨在开发针对猪和牛病原体疫苗的努力。尽管针对脑膜炎奈瑟菌的Tf受体疫苗研发进入了人体I期试验，但商业疫苗的追求最终被放弃，同样，使用完整天然TbpB蛋白的动物疫苗研究也未产生商业产品。

不追求基于TbpB的商业疫苗开发的原因尚不清楚，尽管有证据最终支持了它们在生存和致病中扮演的关键角色。在缺乏Lf受体菌株的人男性尿道挑战模型中，研究表明Tf受体是实验性感染所必需的，但Lf受体的存在提供了竞争优势。同样，TbpB和TbpA都被证明是猪胸膜肺炎放线杆菌感染所必需的。商业疫苗开发的挑战包括TbpBs的抗原多样性，最初对于开发针对脑膜炎奈瑟菌的疫苗似乎是可管理的，因为似乎四种代表性TbpB变体可以诱导针对所有已知TbpB变体代表组的杀菌抗体。对于兽医疫苗来说，需要多种蛋白质变体以满足低生产成本要求是一个更大的问题。TbpA的商业生产更加成问题，因为它必须从外膜中提取，并且去污剂和LPS最终必须从制备物中去除。

当第一个TbpB晶体结构解析后，基于TbpBs的疫苗重新引起了兴趣，随后设计了一种结合Tf有缺陷的突变TbpB，在猪中提供了更好的感染保护。其原理是在天然宿主免疫期间，结合界面不会被Tf阻断，这适用于人类和动物病原体。一旦获得了脑膜炎奈瑟菌TbpA-Tf复合物的结构，它为设计源自Tf受体的抗原提供了额外机会。使用TbpB C叶作为支架展示TbpA表面环的杂交抗原的设计和生产，为工程化具有改进免疫学特性的抗原提供了一个额外平台。由于Tf受体是理想的疫苗靶点，利用抗原设计的新工具开发能够提供全面和持久感染保护的疫苗抗原潜力巨大。

在人类和牛中，奈瑟菌科和莫拉菌科的病原体中存在Lf受体蛋白，且它们与Tf受体蛋白的结构相似性，使它们成为有吸引力的额外疫苗组分，可采用与Tf受体疫苗设计相似的策略进行抗原工程。由于Tf和Lf受体蛋白在转运过程中将定位于肽聚糖层的间隙，针对这些蛋白的抗体簇聚可能大大增强免疫反应的保护效果。

Host specificity and the evolution of Tf and Lf receptors

地球原始海洋中存在大量亚铁离子，被认为是早期氧化还原反应的催化剂，这也是为什么铁对当今几乎所有生命形式都必不可少。地球逐渐氧化和 resulting 三价铁离子的不溶性，导致了原核生物铁获取系统的发展以及细胞内铁储存系统的出现。在革兰氏阴性菌中，产生和分泌具有 increasing 亲和力和复杂性的铁螯合分子（铁载体）的同时，伴随着摄取系统以转运铁-铁载体复合物穿过外膜进入细胞。TonB依赖性转运蛋白（TBDTs）是这些铁摄取系统的一个组成部分，需要内膜ExbBExbD复合物通过ATP水解提供能量——这一过程还需要肽聚糖层中的间隙，以便TonB与TBDT相互作用并转运铁或铁-铁载体复合物穿过外膜。随后铁或铁-铁载体复合物穿过周质空间进入细胞需要周质结合蛋白和内膜转运复合物。TbpA与FbpA相互作用的证明表明，铁从外膜转运到细胞质也需要肽聚糖层的间隙，这可能提高所有TBDTs转运金属离子的效率。

正如先前提出的，革兰氏阴性菌中的TBDT必须是当今Tf和Lf受体衍生而来的祖先，而Tf和Lf通过基因复制的顺序发展及其在黏膜表面的出现是Tf和Lf受体发展的驱动力。推断它应该是一个类似于参与从铁载体获取铁的TBDT，但它们不是逻辑上的祖先，因为它们转运铁-铁载体复合物而不是铁穿过外膜。可能还有其他不依赖铁载体的TBDT系统更直接地捕获三价铁或三价铁离子复合物，例如卡他莫拉菌的CopB，它是FetA（奈瑟菌属）和IrpA（牛莫拉菌）的同源物，可以在含有较低浓度铁载体的丰富培养基上支持生长——这一表型通过突变参与结合三价铁的残基而被消除。值得注意的是，CopB已被证明可以将铁转移给FbpA，一种结合三价铁的周质铁结合蛋白；因此，CopB比将铁载体-铁复合物转移给周质结合蛋白的铁载体受体更代表一个可能的祖先。

ancestral TbpA2的产生过程可能发生在很长一段时间内，在此期间，Tf的单叶前体出现以从海水中捕获铁，然后通过基因复制事件产生Tf。带有TbpB脂蛋白的双组分受体可能出现在合弓纲和蜥臀目谱系分裂之前，因为它存在于爬行动物、鸟类和哺乳动物中。一项 elegant 的研究表明，人类病原体TbpA的特异性是在4000万年的灵长类进化过程中通过对Tf上被TbpA识别的残基进行选择压力而产生的。通过扩展这一观察，来自爬行动物、鸟类和哺乳动物的细菌中TbpAs对宿主Tf的特异性发展了超过3.2亿年。Lf的前体在约1.25-1.5亿年前的真兽类祖先中通过Tf基因的复制而产生，保留了结合铁的高亲和力，因此可能作为表达TbpBA受体的革兰氏阴性菌的铁源。这显然为驻留在上呼吸道的革兰氏阴性菌中tbpBA操纵子的复制提供了机会，使其能够与Lf共同进化，从而保留从这一额外铁源获取铁的能力。

由表面脂蛋白组装模块分泌系统分泌的表面脂蛋白通常由单个叶组成，表明当前的双叶TbpB蛋白可能 preceded by 一个单叶前体。来自鸟类和哺乳动物谱系的当前双叶受体的整体相似性表明，双叶TbpB蛋白出现在这些谱系分化之前。然而，TbpB蛋白存在 substantial 序列差异，并且它们与宿主Tf相互作用的 clear 差异经历了3.2亿年的共同进化。产生Lf前体的基因复制事件使该蛋白承担了许多其他角色，因为它不再需要在铁稳态中扮演关键角色。它由腺细胞和中性粒细胞分泌，在对抗感染、调节免疫反应中扮演多种角色，该基因也参与肿瘤抑制。关于其在对抗感染中的作用，一个显著特征是其带正电荷的N端产生抗菌阳离子肽，这导致了LbpB蛋白中带负电荷区域的产生。

Structural and functional characteristics of the lactoferrin receptor proteins

TbpB的出现使从Tf获取铁更有效率，LbpB logically 在捕获和从Lf中去除铁方面扮演类似角色。长的非结构化锚定肽区域的存在使TbpB和LbpB能够从外膜表面延伸相当长的距离以捕获Tf和Lf。由于TbpAs和LbpAs可能簇聚在肽聚糖层的间隙周围，TbpB和LbpB沿外膜表面横向移动的能力将使初始捕获Tf和Lf更有效率。值得注意的是，锚定肽长度为40-75个氨基酸，可以向外延伸以捕获Tf并将其穿过荚膜多糖带到TbpA。截短锚定肽区域的N端部分阻止了三元Tf-TbpA-TbpB复合物的稳定形成，但TbpB捕获载铁Tf会触发三元复合物形成以从Tf中提取铁的机制尚未阐明。尽管尚未对LbpB进行 comparable 研究，但当Lf受体从Tf受体进化时，该机制 logically 被保留。

证明来自不同人类病原体的LbpB提供了对人Lf产生的阳离子肽lactoferricin的保护，使作者预测这与LbpBs C叶中存在的带负电荷区域有关。在随后的研究中，来自脑膜炎奈瑟菌LbpB的带负电荷区域被证明能 dramatically 减少lactoferricin的杀伤。还观察到自转运蛋白NalP导致LbpB从细胞表面释放，这增强了对lactoferricin的保护，尤其是在更高水平时。奈瑟菌属和卡他莫拉菌的LbpB C叶中的一个或两个环通过带负电荷氨基酸簇 readily 被识别，并被认为是拥有lbpBA基因的细菌病原体所独有的。最近在分析流感嗜血杆菌菌株TbpB序列多样性时，一个有趣的观察是存在一个带负电荷氨基酸簇，类似于奈瑟菌属和卡他莫拉菌LbpB中发现的区域，并且位于相同的C叶环中。在巴斯德菌科的牛或猪病原体的TbpBs中尚未注意到这一点，它们不拥有Lf受体，但这提出了一个问题，即这种策略是否可能在病原体，尤其是共生菌中更广泛地实施，因为Tf和Lf受体在非人类宿主共生菌中的普遍性先前未被检验。

与带负电荷簇相反，来自反刍动物的莫拉菌属在环区域有更大的多肽，似乎没有 clear 的负电荷特征，并且在牛莫拉菌中达到30 kDa。来自牛莫拉菌的大的30 kDa C叶α螺旋结构域（CaHD）被单独产生，并对其结合和生物物理特性进行了广泛分析。添加CaHD不仅保护了缺乏LbpB的牛莫拉菌菌株免受阳离子肽影响，而且也能保护大肠杆菌。CaHD能够结合Lf并抑制阳离子肽的释放，或形成大的凝聚复合物以隔离从而抑制阳离子肽的活性。

牛莫拉菌和脑膜炎奈瑟菌LbpB N叶的结构被解析，为识别潜在的Lf结合配体提供了机会。最近，为奈瑟菌LbpB-Lf复合物开发了结构模型，随后通过晶体学和冷冻电镜进行了结构测定，提供了相互作用的详细图景。LbpA在整体结构上与TbpA非常相似，具有N端 plug 区域和C端22链β桶，具有11个外部表面环，形成结合Lf的界面。涉及结合TonB的N端 motif 与TbpA中的区域相似但不相同（KEATGLGK vs. NEVTGLGK），但涉及转运铁穿过外膜的区域在两种蛋白质中是相同的（GAINEIEYE），表明其 plays a critical role in iron transport。我们的解释是，TonB结合区域的序列差异不是功能差异的反映，而是由于允许非必需氨基酸变异的长期进化所致。还显示了参与分离Lf C叶结构域的环3α螺旋。目前没有TbpA或LbpA单独的结构，这可能是因为大的表面环具有足够的构象灵活性和运动性，阻碍了蛋白质 alone 的晶体形成。唯一可用的TbpA结构是与Tf复合的结构，其中表面环 likely 发生了 substantial 位移以适应Tf的结合， commensurate with Tf C叶结构域的分离以促进铁 removal。

Prevalence of bacterial Tf and Lf receptors from genomic sequences

早期研究表明，所有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌菌株都能够在缺铁培养基上依赖人类Tf生长，而这种能力仅存在于少数共生奈瑟菌分离株中。使用人类Lf的研究也有类似观察， except that 利用它生长的能力并非存在于所有淋病奈瑟菌菌株中。这为从脑膜炎奈瑟菌中分离宿主特异性Tf和Lf受体蛋白奠定了基础，随后使用这些方法鉴定和表征了来自人类和食品生产动物其他病原体的这些受体蛋白。这种方法使我们能够从三个细菌科（巴斯德菌科、奈瑟菌科和莫拉菌科）的各种物种中鉴定这些受体蛋白，但这些受体蛋白在哺乳动物宿主共生菌种中的普遍性，或关于Tf，在脊椎动物宿主中的普遍性，则不太清楚。在缺乏直接从它们可能驻留的区域分离能够从宿主Lf获取铁的细菌的直接方法的情况下，我们转向使用大型序列集合进行生物信息学预测。

为确保本综述使用最新的序列数据，我们在2024年7月进行了分析。我们收集了120个推定的LbpA/TbpA序列簇——每个簇代表共享>90%同一性的任意数量的序列——使用一组序列 motif 将它们分类为可能的LbpA或TbpA，并使用系统发育树检查了它们的关系。该树显示LbpAs与TbpAs well separated， each found in its own monophyletic clade。15个LbpA簇代表来自24个不同分类群的811条序列，尽管所有都来自2个属。我们鉴定了来自15个奈瑟菌分类群的771条序列：脑膜炎奈瑟菌（609）、淋病奈瑟菌（68）、乳糖奈瑟菌（32）、bergeri奈瑟菌（26）、cinerea奈瑟菌（12）、blantyrii奈瑟菌（6）、subflava奈瑟菌（3）、flavescens奈瑟菌（1）、mucosa奈瑟菌（1）、basseii奈瑟菌（1）、benedictiae奈瑟菌（1）、uirgultaei奈瑟菌（1）、polysaccharea奈瑟菌（1）、sicca奈瑟菌（1）以及来自未分类物种的（8）条序列。我们鉴定了来自9个莫拉菌分类群的40条序列：牛莫拉菌（15）、bovoculi莫拉菌（9）、ovis莫拉菌（6）、caprae莫拉菌（2）、haemolytica莫拉菌（1）、nasicaprae莫拉菌（1）、oblonga莫拉菌（1）、oculi莫拉菌（1）以及来自未分类物种的（4）条序列。

还使用了一种并行方法，专注于扫描基因组中是否存在功能 motif GAINEIEYE 和 NEVTGLGK/KEATGLGK，关注基因组背景和邻近基因的特性。特别是，LbpA和TbpA都在基因组中位于其同源结合伙伴脂蛋白lbpB和tbpB旁边。通常很难使用序列同一性来区分它们，但LbpB蛋白具有特征性的带负电荷氨基酸 stretches。此外，由于Tf受体出现在Lf受体之前，仅包含单个推定受体的细菌最可能拥有TbpA而不是LbpA，因此当检测到至少2个TonB依赖性受体，每个都位于表面脂蛋白旁边，并且其中一个脂蛋白包含带负电荷氨基酸 stretches 时，可以暗示lbpAB的存在。

使用这些标准，我们在8个奈瑟菌分类群中发现了推定的LbpA蛋白：脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、bergeri奈瑟菌、blantyrii奈瑟菌、cinerea奈瑟菌、乳糖奈瑟菌、mucosa奈瑟菌和sicca奈瑟菌。我们还在7个莫拉菌分类群中发现了推定的LbpA蛋白：牛莫拉菌、bovoculi莫拉菌、ovis莫拉菌、nasicaprae莫拉菌、haemolytica莫拉菌、卡他莫拉菌和macacae莫拉菌。这些与我们之前方法的发现 largely agree，允许搜索数据库的差异。我们还从一些新颖且有趣的分类群中检测到推定的LbpA蛋白：Conchiformibius steedae，一种从狗中分离的奈瑟菌科物种；Taylorella equigenitalis，一种来自Betaproteobacteria纲Alcaligenaceae科的物种，从马中分离；以及Frederiksenia canicola和Otariodibacter oris，两者都是巴斯德菌科的物种。这些来自奈瑟菌和莫拉菌以外属的推定命中可能代表了第一批新的真正 divergent 的LbpA例子，但它们不被先前方法中使用的分类 motif 识别，必须在没有生化表征的情况下被视为初步命中。

过去关于Tf和Lf受体在哺乳动物中以及Tf受体在脊椎动物中普遍性的研究，主要是通过对人类病原体和相关物种的研究，以及对食品生产动物病原体的更有限研究。基因组测序效率和成本的降低提供了来自栖息在更广泛哺乳动物和脊椎动物宿主范围细菌的序列信息，但仍然 strongly bias towards 被认为具有医学或经济重要性的物种。此外，即使是这些测序方法也 primarily 采样最普遍的物种，并且可能无法识别低于检测水平的细菌。

Methods differentiating LbpA and TbpA sequences

由于TbpA和LbpA共享 significant 序列相似性， novel 序列的分类 cannot be reliably performed using simple measures like sequence identity。MEME软件套件是 often used 的工具来克服这个问题，因为它识别的序列特征与序列本身相比在进化时间上更稳定。我们以两个已知的LbpA序列开始：来自脑膜炎奈瑟菌（NCBI登录号WP_101148291.1）和牛莫拉菌（WP_264682778.1），以及三个已知的TbpA序列：来自脑膜炎奈瑟菌（AAF81744.1）、牛莫拉菌（WP_078274888.1）和胸膜肺炎放线杆菌（ALA40020.1）；我们将这两组已知蛋白质称为“种子序列”。NCBI clustered_nr数据库将非常大的nr数据库 collapse 成由共享>90%同一性的序列组成的簇，这 dramatically lowers the complexity of computational analyses and helps to remove some bias from over-represented species。两组种子序列用于使用程序BLASTp在2024年7月搜索clustered_nr数据库，过滤覆盖每个查询>65%且共享>60%序列同一性的结果。LbpA种子和TbpA种子分别返回11和18个唯一位点，我们称之为“高置信度序列”。使用程序MEME v5.5.5识别由LbpA高置信度序列共享但TbpA高置信度序列不共享的序列 motif。

类似地，使用命令识别了TbpA序列 motif。发现这些 motif clearly differentiate 两组序列。

Collecting and classifying putative LbpA and TbpA homologues using sequence-based methods

LbpA和TbpA种子序列用于在2024年7月使用程序PSI-BLAST进行三轮搜索clustered_nr数据库，以最大化我们搜索的敏感性。命中被过滤为覆盖每个查询>65%且最大E值为1E-140的结果。LbpA和TbpA种子分别返回182和189个唯一位点，当 combined 时仅产生总共190个推定同源物，突出了我们使用序列 motif 进行分类的必要性。这些推定同源物使用程序MAFFT v7.475进行比对。

使用程序RAxML v8.2.12重建了系统发育。

190个同源物使用先前描述的序列 motif 被分类为可能LbpA、可能TbpA或未知。 specifically，15个可能LbpA被鉴定为包含所有6个LbpA motif 且顺序正确（除非截短），65个可能TbpA被鉴定为包含至少6个8个TbpA motif 且顺序正确（除非截短）。可能LbpA和可能TbpA都被发现在 nonoverlapping monophyletic clades 中，这些 clades 在系统发育树中是 direct siblings；这些特征 lend credibility to our classification scheme，因为它们是 paralogue 进化随后经历功能专业化的预期特征。这两个 clades 覆盖了树中的120条序列，我们称之为“推定LbpA/TbpA序列”；然后提取这些序列并进行更仔细的分析。

使用与上述相同的方法为推定LbpA/TbpA序列生成比对和系统发育。由于这些序列中的每一个都是一个代表共享>90%同一性序列的簇，从PSI-BLAST结果中提取了15个LbpA序列簇的分类 breakdown 并进行了探索。

Identifying putative LbpA homologs using genomic context methods

通过使用关键词“lactoferrin/transferrin family TonB-dependent receptor”和“TonB-dependent hemoglobin/transferrin/lactoferrin family receptor”在2024年7月搜索NCBI蛋白质数据库，收集了一组初始推定序列。去除冗余序列，然后过滤那些包含 motif GXXNEIEXEN，或同时包含 motif NXXEYE 和 VXGLG 的序列。剩余序列 highly likely 是LbpA或TbpA。使用这些剩余序列通过BLASTp搜索clustered_nr数据库，产生了一大组推定同源物。然后使用MEME套件在线版本中可用的Find Individual Motif Occurrences工具过滤那些包含 motif GAINEIEYE 和 TGLGK 的序列。从这组命中簇中提取物种信息，并用于定义后续搜索的基因组列表。

使用来自相应物种的整个推定LbpA/TbpA同源物集合，通过tBLASTn搜索每个基因组。这些结果通过筛选每个命中上游区域是否存在“Tf结合蛋白样溶质结合蛋白”以识别 likely 配对进行手动策划。包含推定LbpA同源物的最终物种列表来自此策划，当一个基因组包含至少两个推定lbpBA/tbpBA对，并且至少一个推定LbpB/TbpB包含带负电荷氨基酸 stretches 时。