镰刀菌G蛋白偶联受体FgSte2与FgSte3在过氧化物酶诱导下发生异源二聚化并调控致病性趋化反应的机制研究

本研究首次证实植物病原真菌镰刀菌（Fusarium graminearum）中的G蛋白偶联受体（GPCR）FgSte2与FgSte3在过氧化物酶（HRP）及其衍生物配体刺激下可形成功能性异源二聚体。通过BRET（生物发光共振能量转移）、亲和共沉淀及共聚焦显微技术，在酿酒酵母异源表达体系中揭示了该二聚化过程依赖于HRP活性，且与真菌菌丝趋化性和致病性密切相关。该发现为阐释GPCR异源二聚化在真菌-宿主互作中的信号转导机制提供了新视角，对开发新型抗真菌策略具有重要启示。

　　

Abstract

镰刀菌（Fusarium graminearum）中的FgSte2和FgSte3是G蛋白偶联受体（GPCRs），已被证明在响应宿主分泌的过氧化物酶活性时参与菌丝趋化性和真菌植物致病过程。本研究基于“趋化性依赖于FgSte2和FgSte3同时存在”这一现象，检验了其可能由FgSte2–FgSte3异源二聚体形成所介导的假说。

Introduction

G蛋白偶联受体（GPCRs）是参与细胞信号转导的最大膜蛋白家族，能够感知多种环境线索（配体）并将胞外信号转导至胞内。经典模型中，GPCRs与由Gα、Gβ和Gγ亚基组成的异源三聚体G蛋白复合物发生相互作用。配体结合引发受体构象变化，导致Gα亚基与Gβγ亚基解离，从而激活下游信号通路。

最初认为GPCRs以独立实体发挥作用，但越来越多证据支持功能性的受体-受体相互作用的存在。GPCR同源或异源二聚化分别指相同或不同类型GPCRs之间形成复合物。这两种过程均可受配体结合调控，并反过来调控差异性配体结合、GPCR运输和信号通路偏好性。这些二聚化过程可发生在膜表面，或在内质网中的蛋白质合成与分选过程中发生，通过改变结合协同性调控配体结合行为。

尽管已有研究强调了GPCR同源与异源二聚化的功能相关性，但同源二聚化是更常见的现象。例如，酿酒酵母中Class D α-因子信息素GPCR Ste2已被证明可发生同源二聚化以传递α-因子信息素依赖性信号。相比之下，目前仅有约25对GPCR异源二聚体被表征清楚。

二聚化相关的结构重排涉及 transmembrane 4（TM4）、TM5以及TM1和TM7，这些区域构成了GPCR二聚体结构中观察到的二聚化界面。受体间的额外相互作用也可定位于N末端（如CCR5同源二聚体）、C末端区域（如δ阿片受体同源二聚体），或通过胞外域半胱氨酸形成共价连接的二聚体（如同源二聚化的代谢型谷氨酸受体mGluR7和钙敏感受体CaR）。对于Ste2同源二聚化，TM1中一个保守的GXXXG基序被证明对二聚体形成至关重要。该基序是一个短而保守的氨基酸序列，常见于许多GPCRs的TM区域，包括Class D a-因子信息素GPCR Ste3的TM3。

先前，我们与其他研究者证明了镰刀菌（Fusarium）、轮枝菌（Verticillium）和木霉（Trichoderma）物种中的Ste2和Ste3 GPCRs参与真菌菌丝朝向宿主释放的过氧化物酶催化反应产物的趋化性。ΔFgSte2和ΔFgSte3缺失株均能完全消除对辣根过氧化物酶（HRP）的趋化反应。这些缺失也导致了对小麦胚芽鞘致病性的降低，尽管对小麦穗部的感染影响较不明显，暗示这些受体在介导感染中可能具有一定作用。机制上，受体缺失分别导致细胞壁完整性（CWI）-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导较野生型（WT）镰刀菌减弱。这些发现共同突显了一个谜团：两种不同的受体，各自被证明可调控100%的趋化活性，为何在缺失另一种受体时均无活性？一种可能的解释是它们的活性依赖于受体异源二聚体的形成。

Materials and methods

Reagents

棉子糖水合物（Cayman chemicals, 16773）。所有其他试剂如无特别说明均购自Sigma?。

Vector constructs and S. cerevisiae strain generation

使用酵母着丝粒载体p415（LEU, GAL1诱导型启动子）和p416（URA3, GPD组成型启动子）表达嵌合蛋白。载体由Barbara Montanini（University of Parma, Italy）惠赠。镰刀菌STE3编码序列经过密码子优化以适应在酿酒酵母中表达，由Biobasics?商业服务合成并克隆至p415载体。其C末端与工程化的深海虾荧光素酶Nano luciferase（NLuc）标签融合，生成融合蛋白。此p415-FgSTE3-NLuc载体称为“供体”。类似地，镰刀菌STE2编码序列亚克隆至p416载体，使其C末端带有黄色荧光蛋白（YFP）标签，因此p416-FgSTE2-YFP作为“受体”。

这些构建体与其他一些构建体单独表达或共表达，以创建BRET分析所需的Test、Positive control和Negative control酿酒酵母菌株。采用了三个重要的阴性对照。首先，单独表达FgSte3-NLuc供体以解释从供体泄漏到受体发射波长的任何信号（Donor alone）。其次，FgSte3-NLuc与一个不相关的GPCR——融合了YFP的牛视紫红质（称为Rho-YFP）共表达，产生Negative（Rho）菌株。第三，在缺少两种报告融合的情况下共表达FgSte3和FgSte2，以解释背景荧光，称为Negative（no reporters（NRs））菌株。

缺失内源性ScSTE2受体的真菌菌株BY4741 YFL026W用于转化。使用锂乙酸法进行转化，并带有轻微修改。鲑鱼精DNA（2 mg/mL）用作载体DNA。将BY4741 YFL026W细胞用适当质粒转化，菌落在SR/-Ura/-Leu平板（合成棉子糖培养基）上生长2–3天。对于转化子的生长，挑取单菌落并在29°C的液体SR/-Ura/-Leu中单独培养。

Confocal microscopy for studying Ste3-NLuc and Ste2 YFP expression and localization

共表达NLuc和YFP标签受体的酵母“Test”菌株在SR/-Leu/-Ura培养基中过夜生长，然后用2%半乳糖诱导。获得的细胞培养物用4 μM HRP酶处理10分钟，随后离心并在冰冷的1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤。它们使用4%多聚甲醛在4°C固定20分钟。为了通过抗体可视化NLuc，将zymolase添加到细胞悬浮液中1小时以消化酵母细胞壁。洗涤后（在PBS中三次），细胞用含有0.01% Triton X-100的PBS透化20分钟。为了减少非特异性结合，将细胞在含有1 mg/mL牛血清白蛋白的PBS封闭溶液中孵育30分钟。随后，细胞在4°C与1:100稀释的小鼠抗NLuc一抗（Promega, cat#7000）在PBS中孵育过夜。洗涤后（在PBS中三次），细胞在室温（RT）黑暗中与1:50稀释的兔IgG抗体偶联的Alexa fluor 647（Thermo Fisher, A-21235）孵育60分钟。然后使用抗褪色Mowiol介质（Sigma, Cat# 81381）封片，并使用Stellaris 5 SR共聚焦激光显微镜（Leica TCS NT, Heidelberg, Germany）成像。

Bioluminescence resonance energy transfer assay

这是一种基于NLuc和YFP（分别融合到FgSte3和FgSte2受体）之间能量辐射转移的邻近性 assay。NLuc被用作供体，YFP作为受体构建体。使用NLuc的优势在于其尺寸较小以及NLuc和YFP发射光谱之间的良好分离。加入Nano-glo荧光素酶底物（Promega, N1110）并被NLuc氧化后，发射出峰值在480 nm的光。如果YFP位于NLuc发光允许距离内（<100 ?），则会吸收此光并进而发射530 nm的荧光。

将转化的真菌菌株在29°C的SR/-Ura/-Leu培养基中生长2天至O.D 0.7–1（密度为2 × 103 cells per mL）。将等体积培养物（50 μL）加至96孔PerkinElmer?白色optiplate的每个孔中，并向其中加入半乳糖至最终优化浓度2%（见下文）。将细胞在29°C孵育3小时以诱导供体FgSte3-NLuc蛋白表达。在记录BRET读数之前，用溶解在PBS中的HRP（终浓度4 μM）处理细胞，并在RT孵育2分钟。在应用信息素的情况下，其应用终浓度为1 μM。此后，加入20 μL按1:1000比例在PBS中稀释的Nano-glo Luciferase Assay底物（Promega?, Madison USA, N1110）。然后使用Spectra max M5e多模式酶标仪获取相对光单位（RLUs）读数。

Preparation of chemotropic ligands and applications to the BRET assay

HRP衍生的配体（先前表征过）通过用0.05 μM浓度的HRP处理1000万镰刀菌孢子6小时（28°C）获得。将孢子以6000 × g离心，收集水相，并通过在95°C孵育10分钟使HRP热失活，仅留下HRP反应的孢子衍生产物，而不是HRP本身。该HRP衍生配体的趋化活性先前已在趋化性平板 assays中得到证实，然后才应用于BRET assays。在其他实验中，将完整的HRP或信息素直接应用于BRET assays。通过 assay 刺激物浓度增加来研究配体（HRP或信息素）浓度与受体BRET饱和度之间的相关性。

Optimization of galactose concentration for expression from p415-FgSte3-NLuc donor vector

进行了半乳糖饱和度 assay 以确定观察到供体饱和度（BRETmax）时的半乳糖浓度。将酵母“Test”菌株培养物样品（50 μL）加至96孔板的每个孔中，并向其中加入从0.01%到8%递增浓度的半乳糖（三重复）。将板在29°C孵育3小时（诱导时间优化后）以诱导驱动FgSte3-NLuc（供体）蛋白表达的GAL1启动子。加入HRP（4 μM），然后向每个孔加入20 μL Nano-glo荧光素酶底物（Promega, N1110）。如上所述收集发光数据。计算BRET50值，并随后用作进行BRET assays的优化半乳糖浓度。

Temporal dynamics of heterodimer formation

由于FgSte3-NLuc供体蛋白的诱导型表达和FgSte2-YFP受体蛋白的组成型表达确保受体在表面表达，观察到的BRET响应相对较快。在加入4 μM HRP或1 μM信息素及荧光素酶后的时间范围内（从0分钟到1小时），使用动力学 assay 测量BRET响应。

FgSte2 and FgSte3 interaction by tandem-affinity pulldown

使用用于BRET的酵母Test菌株。将细胞在含有2%半乳糖的SR/-Ura/-Leu培养基中生长2天，并暴露于4 μM HRP 10分钟。将过氧化物酶处理过的细胞通过以4000 × g离心10分钟沉淀，重悬于5 mL PBS中，并通过涡旋与玻璃珠一起裂解。所有步骤除非另有说明均在4°C进行。将溶解的膜蛋白以1:1比例稀释于稀释缓冲液中，并与GFP trap beads（ChromoTek; AB_2631357; 对结合YFP标签蛋白具有95%效率）在4°C过夜 end-over-end 混合。用洗涤缓冲液洗涤珠子三次，每次通过重力沉降。去除上清液。使用50 μL酸性洗脱缓冲液从珠子中提取结合蛋白。加入SDS样品缓冲液，样品在RT孵育15分钟。通过SDS-PAGE（10%丙烯酰胺）解析溶解的蛋白质，并使用标准湿式电印迹方案转移至硝酸纤维素膜。用1:1000稀释的抗NLuc抗体（Promega cat#7000）探测印迹，并通过化学发光检测条带。

Statistical analysis

所有BRET实验包含至少三个技术重复，并至少重复两次。使用Graph pad prism（version 9.0, Graphpad Software, San Diego, CA）的单因素方差分析（ANOVA）和多重均值分离模块计算统计差异并比较均值。使用假设单个结合位点的非线性回归方程进行曲线拟合。

Results

Validation of recombinant co-expression of BRET-related fusion proteins FgSte3-NLuc and FgSte2-YFP in S. cerevisiae

在酿酒酵母中重组表达FgSte3-NLuc和FgSte2-YFP融合构建体以启用BRET分析。通过共聚焦成像验证BRET构建体的共表达。最初对共表达供体和受体受体构建体的Test菌株进行成像。对于FgSte2-YFP，其表达受组成型p416 GPD启动子控制，在绿色通道中观察到强信号。对于检测受诱导型p415 GAL1启动子控制的FgSte3-NLuc，采用了间接免疫荧光。在酵母细胞壁消化和透化后，依次将抗NLuc抗体和与荧光团Alexa Fluor 647（红色）偶联的IgG二抗添加到细胞中。在shmoo区域观察到显著的红色集中。这种分布与先前报道的酿酒酵母schmoo中ScSte3p的定位一致。同时，在细胞内部也观察到显著较低但仍可见的绿色和红色扩散荧光，一些绿色也勾勒出细胞膜中的细胞。如上所述处理的阴性对照（NR）菌株也进行了成像以解释自发光背景信号。总体而言，Test菌株细胞群的52%显示FgSte2-YFP表达，10%的观察到的Test菌株细胞群显示FgSte3-NLuc表达，3%的观察到的Test菌株细胞群显示两种构建体的共表达。

Optimization of S. cerevisiae FgSte3-NLuc and FgSte2-YFP BRET assay parameters

最初优化了半乳糖诱导的酿酒酵母中FgSte3-NLuc供体表达水平。半乳糖饱和度 assays 显示双曲线。使用诱导型GAL1启动子驱动供体FgSte3-NLuc蛋白表达，发现BRET信号随半乳糖浓度增加而增加，表明供体表达增加，进而受体二聚体形成增加，在5.6%半乳糖时达到饱和。该值称为BRETmax，表示在表面受体相互作用饱和时达到的最大BRET信号，此时每个供体与一个受体相互作用。为了排除由于供体蛋白过表达而检测到假信号的可能性，计算了BRET50值。BRET50指示当受体同时在同一细胞中共表达时形成复合物的概率，对应于达到饱和时最大BRET信号50%的受体-YFP/受体-NLuc比率。它描述了BRET伙伴彼此之间的相对亲和力。此处获得的BRET50值为2%半乳糖，随后用于所有BRET assays以及上述共聚焦成像。这与Negative（Rho）菌株形成对比，后者未观察到受体结合或BRET比率的变化。通过Western Blot验证了在2%半乳糖诱导下FgSte3-NLuc的表达。

最后，还研究了HRP的最佳浓度。将不同浓度的HRP应用于菌株培养物，并通过BRET监测对受体相互作用的影响。观察到明确的关系，即HRP浓度增加导致BRET增加，受体饱和在4 μM HRP时实现。因此，选择并使用4 μM HRP进行所有后续BRET实验。超过4 μM后，观察到急剧下降，可能对应于内化后异源二聚体的解离，或者更可能代表更高浓度的HRP对BRET机制（最显著的是荧光素酶底物）的干扰。后一种想法基于对Positive control菌株观察到类似BRET活性下降的观察。

Exposure to HRP yields a strong BRET signal from S. cerevisiae co-expressing FgSte2-YFP and FgSte3-NLuc

基于上述获得的优化参数，Test的BRET分析在暴露于HRP时产生了110 mBRET的显著BRET信号。这表明FgSte2和FgSte3受体之间的异源二聚化，与将Ste2-YFP构建体替换为Rho-YFP的Negative（Rho）对照的低BRET信号形成对比。Negative（Rho）菌株缺乏BRET响应突出了Test菌株相互作用的特异性。将供体5000 RLU和受体2000 RLU设置为信号被视为显著的阈值值，这些条件在Test、Positive和Negative（Rho）对照菌株中按预期满足。具有NR融合的Negative（NR）菌株显示出非常低的荧光信号，代表背景发射，如上所述，并从Test菌株和Negative（Rho）菌株值中减去。为了解释可能重叠到YFP发射光谱中的来自NLuc的背景发射，使用来自FgSte3-NLuc Donor-alone对照菌株的在480和530 nm的发射来计算Donor-alone BRET比率，该比率也从所有其他菌株获得的值中减去。

随后，研究了不同配体刺激FgSte2和FgSte3之间异源二聚体形成的能力。将加入4 μM HRP观察到的netBRET比率与用1 μM信息素a-factor和α-factor处理产生的比率进行了比较。事实上，在存在0–10 μM信息素的情况下未检测到任何BRET响应的证据。此外，当HRP在应用于 assay 之前用其抑制剂（1 mM SHAM）处理时，观察到的BRET响应完全消失。有趣的是，我们还测试了3 μL的HRP衍生配体提取物（先前表征过），其产生了与直接添加HRP相比接近最大响应一半的响应。这些BRET结果共同强调了HRP（和HRP衍生配体）诱导的FgSte2和FgSte3之间异源二聚化的特异性。应用HRP后缺乏任何显著的时间依赖性表明，在首次监测样品后5分钟，异源二聚体形成已经基本饱和。正如预期，对于α-factor，未观察到显著的时间依赖性BRET响应，验证了其添加后未诱导异源二聚化。也就是说，必须记住信息素添加可能改变这些受体的细胞定位从而影响观察到的BRET响应的可能性。

Validation of the formation of a peroxidase-induced FgSte2–FgSte3 heterodimer by tandem affinity pulldown

为了验证FgSte2–FgSte3受体异源二聚化，使用Test、Negative（NR）和Donor-alone菌株进行了串联亲和共沉淀实验。在表达和溶解膜受体后，将获得的含有去垢剂的细胞裂解物用抗GFP琼脂糖珠（已知对YFP也有亲和力）进行免疫沉淀，然后通过Western blot分析探测FgSte3-NLuc的存在。对于Test菌株，观察到一个大约75 kDa的 prominent 条带，代表重组FgSte3-NLuc的单体形式，与预测的分子量73,460 Da相比。在Negative（NR）或Donor-alone菌株中未观察到75 kDa条带，强调了抗体的特异性以及NLuc本身对抗GFP琼脂糖珠没有任何亲和力。

Discussion

GPCRs是重要的信号分子，在细胞响应外部刺激的众多生理过程中扮演关键角色。已知GPCRs通过配体结合被激活，并被认为可以独立工作或形成同源或异源二聚体以启动下游信号事件。GPCR异源二聚化已被证明控制着与受体单体版本功能不同的广泛细胞和生理过程。

在植物病原真菌镰刀菌中，我们已经证明两种GPCRs，FgSte2和FgSte3，参与介导对宿主衍生过氧化物酶的趋化反应。每个受体的单独缺失废除了对过氧化物酶的趋化反应，强调每个受体仅在另一个受体存在时才具有活性。现在，通过BRET assays和亲和共沉淀使用重组酿酒酵母系统，我们证明了在HRP和HRP衍生配体刺激下FgSte2和FgSte3之间异源二聚体的形成。机制上，这种异源二聚化可以解释为何在缺少另一个受体的情况下，两个受体都不能主动介导趋化性。

配体诱导的异源二聚化已在多种GPCRs中得到证明。例如，CXCR4和δ-阿片受体在分别用其激动剂SDF1α和[d-Pen2, d-Pen5]enkephalin诱导时形成二聚体。在FgSte2–FgSte3 HRP诱导的异源二聚化案例中，这引出了一个问题：配体是什么？过氧化物酶可以进行“过氧化”反应，将单体化合物（如 monolignols）聚合成聚合结构（如木质素）；或者，过氧化物酶可以进行羟基化反应，例如针对现有的多糖链，释放更短的糖链甚至单体糖单元。

关于配体性质鉴定的研究，我们实验室先前的研究表明，形成的配体是真菌来源的，酶底物呈现在镰刀菌的细胞壁或细胞膜上或两者上，这些都是过氧化物酶底物的丰富来源。无论如何，在此模型中，HRP衍生的配体负责在结合一个或两个FgSte2和FgSte3后诱导受体异源二聚化。确实，虽然对提取的HRP衍生配体的部分响应暗示了配体刺激的异源二聚体，但由于HRP衍生配体的身份尚未知，其绝对浓度无法确定，因此我们此时避免进一步推测。或者，我们还注意到镰刀菌受体在酿酒酵母中显著的细胞内定位，不在细胞膜中。这种定位可能符合GPCR内化后的替代（或偏向）信号转导机制，正如其他GPCRs所显示和广泛综述的那样。无论如何，配体介导的受体激活和二聚化可能随后导致基于NOX表达的上调（见下文），产生更多H₂O₂并允许HRP制造更多配体，形成一个前馈循环。

关于GPCRs和NOX之间的关系，在尖孢镰刀菌中，已显示NOX表达调控趋化性弯曲。具体来说，尖孢镰刀菌中NOX基因的缺失消除了趋化性，其中向外源性H₂O₂添加到ΔnoxB和ΔnoxR敲除体中挽救了趋化性生长。这些发现强调了这些酶和H₂O₂在介导趋化性中的重要性。然而，H₂O₂并未挽救ΔFoste2菌株的趋化性，表明H₂O₂在该系统中不直接激活CWI-MAPK。因此，这一结果支持了H₂O₂的作用是通过受体介导的观点，与配体结合介导的模型一致。同时，暴露于HRP的WT镰刀菌中的转录组分析显示NOX家族基因、6-羟基-d-尼古丁氧化酶（FGSG_03616）的上调，在Fgste3Δ菌株中未观察到该效应。这强调了NOX表达、过氧化物酶活性和FgSte3信号传导之间的联系。最后，值得注意的是，除了镰刀菌之外，还检测到NOX和GPCRs之间的额外相互作用。例如，发现配体结合诱导ANG II和血清素（5-HT）均可诱导NOX样酶的激活，导致细胞内ROS的产生。ROS的积累进而导致激活p38 MAPK通路，介导ANG II依赖性细胞肥大。

此外，不能忽视HRP单独可以刺激酿酒酵母中FgSte2-FgSte3异源二聚体形成这一观察。这一观察必须得到以下任一支持：（i）酿酒酵母呈现与镰刀菌相似的过氧化物酶底物，用于产生配体，或（ii）实际上是由过氧化物酶活性产生的更普遍的ROS爆发机制在起作用。确实，过氧化物酶，包括HRP，是更大ROS系统的重要组成部分。虽然高浓度ROS会对蛋白质、脂质和核酸造成损害，但低水平ROS已知在细胞信号传导中发挥作用，包括调节离子通道、蛋白质磷酸化和转录因子。因此，ROS爆发导致FgSte3和FgSte2异源二聚化的观点虽然在此未得到实验支持，但不能严格排除。尽管如此，有趣的是，最近从酿酒酵母中分离出低水平的趋化性刺激HRP衍生配体，进一步支持了配体刺激的概念。

最后，值得注意的是，其他先前关于这些真菌信息素受体的报告强调了它们彼此之间的相互依赖性（如果不是直接物理相互作用的话）。在酿酒酵母中，为了实现交配，可扩散的α-（WHWLQLKPGQPMY）和a-（YIIKGVEWDPA）交配因子信息素必须同时结合它们各自的ScSte2p和ScSte3p受体以引发交配响应，有一些证据表明两种受体共定位以形成schmoo。此外，在交配后期阶段，膜并列被认为是由酿酒酵母中信息素刺激的Ste2和Ste3受体之间的跨膜相互作用介导的。在另一个例子中，在尖孢镰刀菌中，已知FoSte2和FoSte3受体以自分泌方式工作，以密度依赖性方式控制分生孢子萌发，其中a-factor的存在可以淬灭α-factor并导致分生孢子抑制。其他已表征的Ste2和Ste3以及其他真菌GPCRs的作用已被更广泛地报道，但超出了本报告的范围。最终，本研究中观察到的FgSte3和FgSte2之间响应过氧化物酶和HRP衍生配体的“经典”异源二聚体形成是这些受体的首个异源二聚体报告，其生物学相关性仍有待验证。

总之，异源二聚体形成独特的信号复合物，增强了GPCRs激活的生理响应和信号通路的多样性。同时，这种额外的多样化水平增加了针对GPCRs设计新颖、更具选择性和特异性药物及抗真菌化合物的潜力。本文报道的FgSte2–FgSte3异源二聚体是这种二聚化现象的一个新的迷人例子。提出的假设指出，过氧化物酶在ROS爆发活性背景下的作用以及HRP衍生配体可能都需要获得激活CWI-MAPK通路的异源二聚体，这一可能性不容忽视。需要进一步的研究（生物物理和结构）来表征这种异源二聚化的分子基础，以开发新型抗真菌药物。

Acknowledgements

我们感谢Drs. John Allingham和Pooja Sridhar的讨论。本报告代表加拿大国家研究委员会通讯第58423