巴斯德毕赤酵母发酵源牛乳铁蛋白的结构与功能研究及其在人类健康中的应用前景

本综述系统评估了通过巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）发酵生产的重组牛乳铁蛋白（rbLf）与天然牛乳铁蛋白（bLf）的结构与功能相似性。研究证实rbLf在分子量（84 kDa）、等电点（pI≈9.4）、氨基酸序列及铁结合能力（>87%饱和度）等方面与bLf高度一致，其特有的高甘露糖型N-糖基化模式（占比45-55%）未影响免疫识别及抗菌（EPEC抑制>50%）、促肠道细胞增殖（>120%）等核心功能，为精准发酵技术生产高价值功能性食品成分提供了科学依据。

　　

引言

牛乳铁蛋白（bovine lactoferrin, bLf）作为乳源铁结合糖蛋白，因其抗菌与免疫调节特性被广泛应用于婴幼儿健康领域，可显著降低呼吸道感染、坏死性小肠结肠炎及迟发型败血症风险。全球69%的bLf产量用于婴幼儿群体，但其在牛奶中低浓度（0.1-0.3 g/L）及高生产成本限制了更广泛的应用。精准发酵技术通过微生物宿主高效表达重组蛋白，为解决bLf供应瓶颈提供了新路径。然而，翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs）尤其是糖基化的物种差异性可能影响重组蛋白的生物活性与安全性，需通过全面结构与功能分析验证其与天然蛋白的相似性。

方法

重组牛乳铁蛋白（recombinant bovine lactoferrin, rbLf）通过基因修饰的巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii）菌株M020生产，该菌株经密码子优化后表达与天然bLf（UniProt ID P24627）完全一致的氨基酸序列。发酵液通过离心、微滤及离子交换色谱纯化，最终经喷雾干燥获得粉状产品。以Sigma-Aldrich的L9507、L047及商业产品Lactoferrin 95+作为天然bLf对照。

结构表征采用多种技术：

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  分子量及完整性：基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）、SDS-PAGE及Western blot

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  糖基化分析：PNGase F释放N-糖链后通过纳米液相色谱-四极杆飞行时间质谱（nano-LC-Q-TOF MS）解析

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  二级结构：圆二色谱（circular dichroism, CD）及微流调制光谱（microfluidic modulation spectroscopy, MMS）

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  三级结构：核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）

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  等电点：等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）

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  铁结合特性：pH依赖的铁释放/饱和实验及电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）

功能分析包括：

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  抗菌活性：针对肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic Escherichia coli, EPEC）的生长抑制

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  免疫调节：脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）结合能力及Toll样受体4（toll-like receptor 4, TLR4）拮抗作用

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  细胞功能：Caco-2细胞受体结合、人肠道隐窝样细胞（human intestinal crypt-like cells, HIEC）增殖实验

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  消化特性：蛋白质消化校正氨基酸评分（protein digestibility corrected amino acid score, PDCAAS）

结果与讨论

蛋白质纯度与一致性

rbLf终产品蛋白纯度达98.5%-99.2%，残留杂质主要为发酵残留的盐类与碳水化合物。LC-MS/MS未检测到酵母宿主蛋白污染。Edman测序显示rbLf N端存在两种序列：主要序列与天然bLf一致，次要序列包含四个氨基酸延伸（EAEA），源于酵母α因子分泌信号未完全切除，但无安全性风险。

分子量与糖基化特征

MALDI-MS测定rbLf分子量为84,481 Da，略高于天然bLf（82,790-83,044 Da），差异主要源于糖基化模式：

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  rbLf仅含高甘露糖型N-糖链（9种结构），以Hex₈HexNAc₂和Hex₉HexNAc₂为主，与天然bLf中45%-55%的高甘露糖结构一致

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  天然bLf额外包含杂合型与复杂型糖链（共64种结构），但rbLf中未发现新颖糖型

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  X射线晶体学证实rbLf糖基化位点（Asn-233, -368, -476, -545）与天然bLf高度重叠

结构相似性

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  二级结构：MMS显示rbLf与bLf的α-螺旋（22.5%）、β-折叠（17.5%）及转角（13.1%）比例无显著差异

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  三级结构：NMR谱图显示蛋白骨架共振峰高度一致，仅糖链信号强度差异反映rbLf糖基化程度更高

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  等电点：rbLf pI值为9.3-9.5，与天然bLf（8.0-10.0）及理论值（9.4）吻合

功能活性保留

1. 1.

   铁结合能力：

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     rbLf铁饱和度达87.6%，接近天然holo-bLf（L047: 91.7%）

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     pH依赖的铁释放（pH=2时释放率8.4%）与再饱和（pH=6时结合率73.1%）特性与bLf无统计学差异

2. 2.

   抗菌与免疫调节：

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     EPEC抑制：50 μg/mL rbLf处理12小时后菌落数减少>50%（P<0.0001）

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     LPS结合：rbLf与LPS结合能力为空白对照的4倍（P<0.001）

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     TLR4拮抗：rbLf使LPS诱导的TLR4活性降低>40%（P<0.0001）

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     DC-SIGN结合实验表明高甘露糖结构未引发异常免疫激活

3. 3.

   肠道细胞作用：

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     Caco-2细胞对rbLf的摄取量与bLf相当

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     HIEC细胞增殖实验显示rbLf促进细胞生长达对照的120%（P<0.0001）

消化特性

PDCAAS评分显示rbLf消化率（89.2%）略低于天然bLf（94.5%），可能与糖链空间位阻有关，但未产生新颖生物活性肽。

结论

巴斯德毕赤酵母发酵生产的rbLf在核心氨基酸序列、二级/三级结构、等电点及铁结合功能上与天然bLf高度一致。其特有的高甘露糖型糖基化模式虽与天然bLf存在差异，但未影响抗菌、免疫调节及促肠道细胞增殖等关键生物活性，且无免疫原性风险。本研究为精准发酵技术生产高价值功能性食品成分提供了结构与功能层面的全面验证，支持rbLf作为天然bLf的生物类似物应用于婴幼儿及成人健康领域。