Omega-3多不饱和脂肪酸通过调节THP-1单核细胞葡萄糖代谢影响免疫代谢功能

本研究揭示了Omega-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）通过调控单核细胞能量代谢重编程发挥免疫调节作用的新机制。研究发现α-亚麻酸（ALA）和二十二碳六烯酸（DHA）能显著降低氧化磷酸化（OXPHOS），促进糖酵解，并鉴定出丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）作为DHA作用的关键靶点。这些发现为n-3脂肪酸在肥胖、2型糖尿病（T2DM）等代谢性炎症疾病的干预提供了新的理论基础。

　　

Abstract

慢性炎症是肥胖和2型糖尿病等疾病的重要驱动因素。增强的细胞葡萄糖代谢可能导致免疫激活加剧。一项人体补充试验表明，n-3多不饱和脂肪酸α-亚麻酸（ALA）能降低单核细胞中的氧化磷酸化。本研究旨在评估ALA和二十二碳六烯酸（DHA）在细胞培养模型中对葡萄糖代谢的直接作用，并探索可能的分子机制。

Introduction

肥胖是全球流行病，在成人和儿童中患病率都很高。在加拿大，约30%的5-17岁儿童被归类为超重或肥胖。这是早期发展不良代谢特征的重要风险因素，促进2型糖尿病（T2DM）和心血管疾病（CVD）等慢性代谢性疾病的发生和发展。其中一个特征是慢性炎症。

单核细胞是血液中最常见的先天免疫细胞类型，通过分泌细胞因子和迁移到感染、损伤或功能障碍部位（如肥大脂肪组织和受伤血管）来促进慢性炎症表型，并在那里分化为巨噬细胞。某些慢性炎症状况与单核细胞生物能量学或能量生成途径的功能障碍有关。

Omega-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）如植物来源的α-亚麻酸（ALA）和鱼油来源的二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA），是具有高治疗潜力的天然产物。一项临床试验表明，在肥胖女性中，每天补充4克ALA（而非DHA）28天，可降低单核细胞中的氧化葡萄糖代谢。

Methods

Cell culture and n-3 PUFA treatment

THP-1人单核细胞在含有10% FBS和0.1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中维持培养。所有脂肪酸储备溶液，包括ALA、DHA和单不饱和脂肪酸对照油酸（OA），均保存在100%乙醇中，并充入氮气以防止氧化。细胞处理时，脂肪酸与1%无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）在PBS中结合，在37°C水浴中孵育1小时。

Seahorse XF analysis

XFe24培养板用35 μg/mL CellTak粘合剂在0.1 mol/L碳酸氢钠（pH 7.4）中包被30分钟。THP-1单核细胞计数后，重悬于Seahorse XF RPMI培养基中，该培养基补充有L-谷氨酰胺、丙酮酸钠和葡萄糖。进行Mito Stress Test或ATP速率测定协议，使用Seahorse XFe24分析仪，包括注射电子传递链抑制剂。

Respirometry analysis

THP-1单核细胞计数后装入Oroboros O₂k Oxygraph，在500 μL新鲜无血清RPMI-1640中测量呼吸速率。使用Oroboros DatLab软件计算OCR参数。

RT-qPCR

使用Monarch Total RNA Miniprep试剂盒提取RNA。使用LunaScript RT Supermix合成cDNA。使用Luna qPCR预混液和Quant Studio 6 Flex仪器量化目标转录本，采用2^?ΔΔCt方法，以β-肌动蛋白为参考基因。

Flow cytometry

使用MitoSOX Red和CellROX Green染料，按照制造商方案制备并施用于细胞，通过流式细胞术（CytoFLEX LX）量化。

Cytokine measurements

脂肪酸处理48小时后，加入10 ng/mL脂多糖（LPS），再孵育2小时。收集上清液，使用Human IL-1β/IL-1F2 DuoSet ELISA试剂盒测量IL-1β水平。

Statistical analysis

使用Prism软件进行分析和绘图。数值数据表示为平均值±标准误，来自至少n=3个独立实验。统计分析方法包括Oroboros实验的未配对t检验和其他实验的重复测量单因素ANOVA及Dunnett事后检验。

Results

Direct treatment with ALA results in lower oxidative phosphorylation rates

首先研究了ALA（0、10、20和40 μmol/L，处理48小时）对THP-1单核细胞线粒体生物能量学的影响。使用Seahorse XFe24平台进行Mito应力测试，测量生物能量参数如基础呼吸、ATP关联OCR和最大呼吸，同时估算ECAR。在40 μmol/L ALA时，基础呼吸和ATP关联OCR均显著降低。还观察到最大呼吸降低和ECAR升高的趋势，但在n=3实验中未达到显著性。

使用Oroboros O2k Oxygraph仪器通过呼吸测量法验证这一发现。与Seahorse结果相似，40 μmol/L ALA处理导致基础和ATP关联呼吸速率相较于载体对照降低。

Both ALA and DHA rewire THP-1 monocyte glucose metabolism

比较了载体、ALA、DHA或OA对照（均为40 μmol/L）处理细胞48小时在Seahorse XF线粒体应力测试中的效果。发现40 μmol/L ALA和DHA均降低了THP-1单核细胞的基础和ATP关联OCR。仅DHA显著降低了最大呼吸和备用呼吸容量百分比。

为了更好地了解细胞的整体能量表型，进一步进行了Seahorse ATP速率测定。发现氧化磷酸化是这些细胞在所有条件下ATP生成的主要方式。40 μmol/L ALA和DHA处理降低了线粒体来源的ATP（MitoATP）。ALA还显著增加了糖酵解产生的ATP（GlycoATP）。总体ATP生成有下降趋势但未达到显著性。

DHA treatment upregulates pyruvate dehydrogenase kinase 4

研究了n-3 PUFA处理对参与葡萄糖分解代谢调控酶转录水平的影响。主要候选是丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4），因为根据转录组微阵列筛选，它被DHA在THP-1细胞中上调。PDK4磷酸化并抑制丙酮酸脱氢酶（PDH）的活性，因此预计会负调控氧化磷酸化。

载体或40 μmol/L ALA、DHA或OA处理48小时后，提取RNA并通过RT-qPCR量化目标转录本。DHA处理的细胞具有显著更高的PDK4 mRNA水平。还研究了线粒体丙酮酸载体1（MPC1）和PDHA1（PDH的催化亚基）的转录水平。MPC1被ALA和OA轻微但显著上调。

Both ALA and DHA reduce oxidative phosphorylation of lipid substrate

在其他细胞和组织类型中，特别是那些具有高能量需求的细胞，PDK4上调将细胞燃料利用从葡萄糖转变为脂肪酸。由于DHA处理在我们的THP-1单核细胞模型中诱导了PDK4，我们在提供棕榈酸（50 μmol/L，与BSA结合）作为主要代谢底物（无葡萄糖）的情况下重复了Seahorse XF代谢通量测定。

意外发现，40 μmol/L ALA和DHA均降低了Mito应力测试参数，包括基础和ATP关联呼吸。DHA和OA还显著降低了最大呼吸和备用呼吸容量百分比。

ALA and DHA both reduce LPS-triggered cytokine production but have disparate effects on reactive oxygen species

鉴于先前报告称向糖酵解代谢的转变在某些髓系细胞（即巨噬细胞和树突状细胞）中促进促炎表型，测试了n-3 PUFA处理对活性氧物种（ROS）和IL-1β（一种促炎细胞因子）水平的影响。

发现40 μmol/L DHA处理（而非ALA）的THP-1单核细胞与载体和OA对照相比，细胞和线粒体ROS标记物有轻微但显著增加。还观察到ALA和DHA以及OA均降低了IL-1β production。

Discussion

n-3 PUFAs作为可能降低肥胖和CVD等代谢性疾病风险因素的膳食或营养保健品疗法，引起了广泛关注。这部分归因于它们在多种病理和细胞类型中已证明的抗炎特性。然而，决定这些有益效应的机制复杂，尚未完全阐明。

本研究确定了n-3 PUFAs对THP-1单核细胞葡萄糖代谢的直接效应。使用Seahorse XF和Oroboros Oxygraph平台，证明ALA处理在提供葡萄糖作为代谢底物时降低了基础和ATP关联呼吸。与载体和OA对照处理相比，ALA和DHA处理均降低了通过氧化磷酸化的ATP production。ALA还增强了通过糖酵解的ATP production，而DHA仅有不显著的倾向。DHA还显著抑制了最大呼吸。此外，DHA强烈上调了PDK4 mRNA。

由于PDK4抑制PDH介导的丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，其活性预计既会抑制氧化磷酸化（因为更少的乙酰辅酶A进入Krebs循环），又会促进糖酵解（因为丙酮酸被转化为乳酸，再生糖酵解所需的电子载体）。因此，PDK4的上调可能解释DHA的代谢重编程效应。

已知PDK4在其他细胞类型中促进脂肪酸氧化；然而，我们在此显示DHA和ALA实际上降低了THP-1单核细胞中脂肪酸底物的氧化磷酸化，与葡萄糖底物类似。值得注意的是，虽然两种n-3 PUFA对生物能量学有相似效应，但在DHA的情况下，这伴随着线粒体和总ROS的增加。最后，ALA、DHA和OA处理均与LPS刺激后IL-1β production减少相关。

这些结果与我们之前的临床试验结果部分一致，该试验发现富含ALA的亚麻籽油补充4周降低了外周血单核细胞中的ATP关联OCR。然而，在人体研究中，富含DHA的鱼油补充对OCR没有可测量的效应，而其在本文中的效应与ALA相似。

选用的细胞培养和细胞处理模型系统并非没有局限性。未分化的THP-1细胞已被广泛用于模拟人单核细胞，显示出相似的功能反应，如细胞因子产生和分化。然而，它们并不一定模拟原代单核细胞的所有特征。最终，我们的结果应在精心控制的条件下在原代细胞中进一步验证。

尽管模型系统存在局限性，这些结果增加了先天免疫细胞免疫代谢研究复杂、有争议且不断发展的领域的一致性。在包括单核细胞在内的多种先天免疫细胞类型中，促炎TLR4配体LPS以牺牲氧化磷酸化为代价促进糖酵解。因此，糖酵解促进或至少支持炎症激活的观点最初得以确立。然而，一些最新研究表明这可能完全取决于 context。

相对较少的研究专门在单核细胞中进行，以帮助解释此处显示的发现。启发我们分析的研究报告称，在符合肥胖标准的女性中，较高的BMI与较高的ATP关联OCR和较低的ECAR相关。这与另外两项临床研究一致，报告称来自T2D参与者或肥胖参与者的外周血单核细胞（PBMC，混合白细胞群体）具有较高的氧化磷酸化速率。

其他发现对这一概括提出质疑。例如，一项饮食诱导肥胖的小鼠研究报告称，高脂饮食（HFD）喂养导致Ly6C^low和Ly6C^high单核细胞中的氧化磷酸化降低。HFD喂养还降低了Ly6C^low单核细胞中的糖酵解，但增加了Ly6C^high单核细胞中的糖酵解。

ROS在调节免疫细胞反应和激活中的作用复杂且有争议。在非造血细胞中，一些研究报告ALA和DHA降低ROS水平。在其他研究中，与我们的发现相似，DHA而非ALA增加线粒体ROS产生。这可能表明低程度的细胞应激。由于已知ROS在某些条件下触发IL-1β产生，我们研究了n-3 PUFA处理对这种细胞因子产生的影响。

既然已经确定了一个潜在的新机制来解释n-3 PUFA如何调控分解代谢途径，正在进行的工作是确定其对单核细胞激活和功能的重要性。将进行PDK4功能丧失实验以确定通过PDK4的代谢重编程是否负责n-3 PUFAs在单核细胞中的任何抗炎效应。由于ALA对PDK4转录水平影响很小，我们继续研究可能解释ALA对单核细胞代谢效应的替代机制参与者。

Acknowledgements

我们非常感谢曼尼托巴大学的Versha Banerji博士和Maxim Skorodinsky以及Paul Albrechtsen研究所-曼尼托巴癌症护理中心在Oroboros O2k Oxygraph测量方面提供的技术培训和协助。