猪肌内前脂肪细胞永生化模型建立及其在脂代谢与内质网应激调控研究中的应用

本研究成功建立了一种新型永生化猪肌内前脂肪细胞系，通过导入HPV16-E6/E7及hTERT基因克服细胞衰老限制，证实该模型在连续传代超过24代后仍保持显著成脂分化能力（表现为脂质积累和FABP4等标志物表达）。研究进一步揭示内质网（ER）应激诱导剂布雷菲德菌素（BFA）可通过激活CREB3转录因子抑制成脂分化，为探讨ER/高尔基体应激调控脂代谢的分子机制提供了优质实验平台，对理解代谢综合征发病机制具有重要意义。

　　

引言

随着全球II型糖尿病（T2D）患病率持续上升，研究影响此类健康风险发生机制的模型显得尤为重要。肌内脂质积累与胰岛素抵抗及代谢综合征发展密切相关。肌内前脂肪细胞为研究脂肪形成提供了独特机会，相较于内脏脂肪等已被深入研究的脂肪库，肌内脂肪库的研究尚不充分。猪因其基因组和生理学与人类高度相似，成为优于小鼠模型的研究人类健康的理想体系。

材料与方法

从3日龄约克夏×长白杂交仔猪的背最长肌中无菌采集组织，通过胶原酶消化法分离基质血管组分（SVF），获得原代肌内前脂肪细胞。为克服细胞衰老限制，采用电转法共转染人乳头瘤病毒16型E6/E7基因（HPV16-E6/E7）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因实现细胞永生化。使用含地塞米松（DEX）、胰岛素（INS）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和罗格列酮（ROS）的DMI培养基诱导成脂分化，并设低DEX（DMI 1）和高DEX（DMI 2）两种配方。采用油红O染色观察脂滴形成，比色法测定甘油三酯含量，通过微滴式数字PCR（ddPCR）和qRT-PCR分析基因表达，Western blot检测蛋白水平。

结果

永生化肌内前脂肪细胞模型的建立与分化潜能验证

成功建立的永生化细胞系可稳定传代超过24代而无明显衰老迹象。qRT-PCR检测证实HPV16 E7基因在不同传代次数（<10、10-20和>20代）的细胞中稳定表达。油红O染色显示，经DMI诱导的细胞中出现大量红色脂滴，而未诱导细胞则无此现象。甘油三酯定量分析表明，分化细胞中脂质含量显著增加（DMI 1：p=0.0013；DMI 2：p=0.0028）。ddPCR检测发现成脂标志物FABP4在分化细胞中呈上调趋势。两种DMI诱导配方未见显著差异。

分化诱导后脂代谢与应激反应靶标的差异表达

基因表达谱分析显示，分化细胞中脂代谢相关基因如PPARGC1A（线粒体生物发生）、SCD（脂肪酸合成）和LPL（甘油三酯水解）显著上调。相反，内质网（ER）应激反应相关基因（ATF6、ARF4）及糖皮质激素受体基因NR3C1表达下调。特别值得注意的是，新近被发现与脂代谢相关的ER应激蛋白CREB3在分化细胞中mRNA和蛋白水平均显著降低。Western blot结果证实PGC-1α和CREB3的蛋白表达变化与转录水平一致。

ER/高尔基体应激剂布雷菲德菌素（BFA）处理对成脂及应激标志物表达的影响

为探究ER/高尔基体应激对成脂分化的影响，使用BFA（15 ng/mL）处理细胞24小时。研究发现，BFA处理导致成脂标志物FABP4表达下降（NI：p=0.054；D7：p=0.050），表明应激条件削弱细胞的成脂能力。同时，BFA特异性诱导了应激反应基因ATF6、CREB3以及囊泡运输基因ARF4的表达，且这种诱导效应在已分化的细胞（D7）中更为显著。Western blot检测到BFA处理后出现CREB3的活化形式（N端片段），表明其转录调控功能被激活。

BFA处理对分化诱导过程中的基因表达影响不显著

尽管BFA急性处理（分化第7天开始24小时）能激活部分应激通路，但当比较相同处理组内分化与非诱导样本时，BFA并未显著逆转成脂分化带来的主要基因表达变化（如FABP4、LPL）。ER/Golgi相关因子（ATF6、CREB3、ARF4、NR3C1）在分化细胞中的低表达状态未被BFA处理显著改变，表明成脂诱导的负向调控占主导地位。

讨论

本研究成功建立的永生化猪肌内前脂肪细胞系，解决了原代细胞迅速衰老、难以长期研究的瓶颈。该模型稳定表达外源 immortalization 基因，并在长期传代后仍维持强大的成脂分化能力，为研究特定脂肪库的 adipogenesis 提供了可靠工具。

基因表达分析揭示，成脂分化伴随脂代谢活化（如PPARGC1A、LPL上调）和ER/高尔基体相关应激通路（ATF6、ARF4、CREB3）的抑制，这与既往研究一致。CREB3作为新晋的脂代谢调控因子，其在下调表明它可能在维持前脂肪细胞状态或抑制分化中发挥作用。

BFA应激实验证明，急性ER/高尔基体应激可激活CREB3等应激因子并抑制成脂，但其效应不足以逆转已启动的分化程序。这与CREB3基因敲除小鼠模型（显示抗肥胖表型）看似矛盾的结果，提示ER应激的时长和性质（急性药物诱导 vs. 慢性代谢适应）可能对脂代谢产生截然不同的调控作用。该模型为深入探讨ER应激、CREB3信号与脂代谢的复杂互作打开了新路径，对理解代谢疾病机制具有重要价值。