EGFR与GLUT1的O-糖基化修饰：调控乳腺癌细胞信号传导与代谢重编程的关键机制

本文深入探讨了O-GlcNAcylation（O-糖基化）修饰在乳腺癌细胞中对表皮生长因子受体（EGFR）和葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的调控作用。研究发现，该修饰通过抑制蛋白质泛素化降解，增强EGFR和GLUT1的稳定性与功能，进而促进下游信号通路（如mTOR和MEK-ERK）激活、细胞周期进程及代谢重组（葡萄糖摄取和乳酸生成）。这一发现揭示了肿瘤代谢重编程与致癌信号通路之间的新型交叉对话机制，为同时靶向代谢和信号通路的乳腺癌治疗策略提供了理论依据。

　　

O-GlcNAcylation of epidermal growth factor receptor and glucose transporter 1 prevents their intrinsic down regulation in breast cancer cells

引言

蛋白质的β-N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）修饰是一种发生在丝氨酸和苏氨酸残基上的重要翻译后修饰。该修饰依赖于己糖胺生物合成途径（HBP）的终产物UDP-GlcNAc，并由O-GlcNAc转移酶（OGT）和O-GlcNAc水解酶（OGA）动态调控。由于O-GlcNAcylation与磷酸化修饰共享相同或相邻的氨基酸残基，两者之间存在复杂的交叉调控关系。近年来研究发现，多种癌症细胞中HBP通路上调导致O-GlcNAcylation水平升高，进而通过修饰癌症促进蛋白支持肿瘤细胞增殖。然而，关于O-GlcNAcylation在乳腺癌细胞中具体调控的蛋白靶点及其分子机制仍知之甚少。

材料与方法

本研究采用T47D和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞模型，通过分子生物学、生物化学及细胞生物学技术系统探讨了EGFR和GLUT1的O-GlcNAcylation修饰功能。实验包括：质粒构建与细胞转染（使用Addgene提供的全长EGFR和GLUT1构建体）；点突变体构建（通过位点定向诱变技术获得Thr¹⁰⁷³Ile-EGFR、Ser¹⁰⁹⁶Ala-EGFR及Ser⁴⁶⁵Ala-GLUT1突变体）；蛋白质稳定性实验（使用蛋白翻译抑制剂环己酰亚胺CHX处理）；免疫沉淀与Western blot分析；体外O-GlcNAcylation实验（使用重组OGT与底物肽段）；代谢谢标记实验（采用Click-iT GlcNAz试剂盒）；葡萄糖摄取和乳酸生成测定（使用Sigma试剂盒）；以及细胞周期分析（通过流式细胞术FACS）。

结果

EGFR和GLUT1含有靠近关键磷酸化位点的潜在O-GlcNAcylation位点

通过生物信息学分析，在EGFR细胞内结构域中鉴定出多个符合p/g-S/T-pY-P1-3特征的潜在O-GlcNAcylation motifs，包括Thr¹⁰⁷³和Ser¹⁰⁹⁶位点，这些位点邻近已知的磷酸化及泛素化位点。同样，在GLUT1中也发现Ser⁴⁶⁵位点具有类似的修饰特征，提示这些位点可能参与调控蛋白质的稳定性和功能。

EGFR和GLUT1在乳腺癌细胞中发生O-GlcNAcylation

体外实验证实重组EGFR和GLUT1可被OGT有效糖基化。在T47D和MDA-MB-231细胞中，免疫沉淀实验进一步验证了内源性EGFR和GLUT1的O-GlcNAcylation修饰。药理抑制OGT活性（使用ST078925）或shRNA敲低OGT表达均导致EGFR和GLUT1蛋白水平下降，而过表达OGT则增加其蛋白水平。相反，过表达OGA降低两者蛋白水平，且该效应可被OGA抑制剂thiamet G逆转。

EGFR和GLUT1中推定O-GlcNAcylation位点的分析

通过代谢标记技术（Click-iT）和体外肽段糖基化实验，证实EGFR的Thr¹⁰⁷³和Ser¹⁰⁹⁶位点以及GLUT1的Ser⁴⁶⁵位点是真正的O-GlcNAcylation位点。突变这些位点显著降低糖基化信号，而磷酸模拟突变（如Thr1073Glu）则未影响蛋白水平。

EGFR Thr¹⁰⁷³和Ser¹⁰⁹⁶位点O-GlcNAcylation的缺失促进泛素化和蛋白质降解

在EGFR敲低的乳腺癌细胞中表达O-GlcNAcylation位点突变体（单突变或双突变Dm-EGFR），发现突变体蛋白水平显著降低，且泛素化程度增加。CHX追踪实验证实Dm-EGFR蛋白稳定性下降。下游信号分析显示，Dm-EGFR细胞中mTOR通路（S6K和4E-BP1磷酸化）和MEK-ERK通路活化受损。

GLUT1 Ser⁴⁶⁵位点O-GlcNAcylation的缺失促进泛素化和蛋白质降解

类似地，GLUT1 Ser⁴⁶⁵突变导致蛋白泛素化增强和稳定性降低。CHX实验证实突变体GLUT1降解加速，而磷酸模拟突变则无此效应。

Dm-EGFR表达的乳腺癌细胞中的细胞周期进程

流式细胞术分析显示，表达Dm-EGFR的T47D和MDA-MB-231细胞在S期进程受阻，细胞增殖能力下降，表明O-GlcNAcylation修饰通过维持EGFR稳定性促进细胞周期进展。

EGFR的O-GlcNAcylation在乳腺癌细胞代谢中的作用

代谢测定发现，Dm-EGFR细胞葡萄糖摄取和乳酸生成显著减少，提示O-GlcNAcylation修饰通过调控EGFR功能影响乳腺癌细胞的糖代谢重组。

讨论

本研究系统揭示了O-GlcNAcylation修饰在乳腺癌细胞中通过调控EGFR和GLUT1的稳定性与功能，整合致癌信号通路与细胞代谢重编程的新型机制。修饰位点（EGFR Thr¹⁰⁷³/Ser¹⁰⁹⁶和GLUT1 Ser⁴⁶⁵）的突变促进蛋白质泛素化降解，破坏下游mTOR和MEK-ERK信号激活，最终抑制细胞增殖和代谢重组。该发现不仅深化了对PTM交叉对话（磷酸化、O-GlcNAcylation和泛素化）在癌症中作用的理解，也为开发同时靶向代谢和信号通路的乳腺癌治疗策略提供了新视角。

研究局限性

本研究未通过质谱直接鉴定乳腺癌细胞中EGFR和GLUT1的O-GlcNAcylation位点，且位点突变可能间接影响蛋白质其他功能，这些需进一步探索。