重组克隆的人工产物挑战了关于质粒共转化、筛选和维持的传统认知

本综述揭示了Gateway克隆系统中存在的高频质粒共转化现象，挑战了关于细菌单质粒转化、抗生素筛选和质粒不相容性的传统认知。研究通过测序和电泳证实，未重组的Entry载体（pDONR）可与Expression载体共转化至同一大肠杆菌（E. coli）细胞，并在无抗生素筛选下稳定共存（发生率9%–29%）。作者提出简易筛选策略，并指出该发现对高通量克隆（如ORFeome库构建）和功能研究具有重要警示意义。

　　

Gateway克隆与传统方法的比较

Gateway重组克隆技术自20世纪90年代末问世以来，以其高效、精准和灵活的特性 revolutionized 克隆技术。与传统依赖限制性内切酶和DNA连接酶的方法相比，Gateway克隆尤其适用于高通量系统生物学研究，如酵母（Saccharomyces cerevisiae）可移动开放阅读框集合、人类ORFeome以及多种生物体的ORF克隆库构建。该技术通过位点特异性重组实现DNA插入片段在不同载体间的转移，同时保持阅读框和方向。

Gateway重组克隆的基本原理

Gateway克隆基于λ噬菌体与大肠杆菌基因组的位点特异性重组反应。利用来自大肠杆菌染色体的attB位点和λ噬菌体基因组的attP位点，Gateway载体可实现DNA插入片段的整合和切除。这一过程仅需两种酶混合物：BP克隆酶（含Integrase (Int)和Integration Host Factor (IHF)）介导attB与attP重组产生attL位点，形成Entry克隆；LR克隆酶（含Excisionase (Xis)、Int和IHF）介导attL与attR位点重组，将插入片段转移至Destination载体，形成Expression载体。各重组反应高度特异，因酶仅识别对应序列位点，且通过att位点亚型（如attB1与attP1）保证插入片段方向的正确性。

Gateway克隆采用正负筛选策略。转化后的大肠杆菌细胞通过常规抗生素进行筛选，而未重组质粒的消除则依赖载体中保留的Gateway盒，该盒含有毒性ccdB基因和氯霉素抗性基因（Cm^R）。ccdB基因产物对多数克隆菌株（如DH5α）具有毒性，从而实现负筛选；而氯霉素抗性用于在抗CcdB毒性的菌株（如DB3.1）中维持Gateway盒。

克隆验证利用att序列中的BsrGI限制位点。Entry克隆经BsrGI酶切可释放插入片段，电泳应显示预期大小的插入片段和载体骨架。Expression克隆 similarly 通过BsrGI酶切验证，但通常不再测序，因Gateway重组的高度准确性。

细菌共转化现象

传统观念认为，转化涉及单个质粒分子进入单个细菌细胞，且通过质粒不相容性和抗生素筛选确保单一质粒维持。不相容质粒具有相同复制起点，竞争复制因子，导致优势质粒 dominance 和次要质粒丢失。抗生素抗性标记用于筛选转化子，并在对应抗生素存在下维持质粒。无抗生素时，无筛选优势的质粒 assumed 会因复制代谢成本而丢失。

共转化指单个细菌细胞同时被两个或多个不同质粒转化。其 rarity 长期被视为实验室常识，但近年研究显示该现象可能比预想更常见。研究使用相同复制起点的质粒观察到同一大肠杆菌细胞中最多11种不同质粒的共转化，包括具有相同复制起点但不同抗生素抗性基因的质粒，以及在分别和同时筛选两种抗生素下的共转化。

Gateway克隆中的质粒共转化

在常规Gateway克隆中，Expression载体验证时有时出现与pDONR Entry骨架共迁移的额外条带。研究通过牛津纳米孔测序和稀释划线 plating 证实，该“神秘”条带并非异常重组产物，而是未重组的Entry质粒与目的Expression载体共转化且无抗生素筛选下维持的结果。这是Gateway克隆中首例共转化记录。

研究对p415GPD-3xHA-GW-yUtp2 Expression载体转化子进行诊断性BsrGI酶切，发现~2 Kbp条带与pDONR Entry骨架共迁移。筛选显示部分克隆同时具有氨苄青霉素（amp）和Zeocin（Zeo）抗性。测序揭示这些克隆含两个 distinct 质粒群体：~4.5 Kbp的pDONR-yUtp2 Entry载体（Zeo抗性）和~9.5 Kbp的p415GPD-3xHA-GW-yUtp2 Expression载体（amp抗性），而非 concatenated 质粒。两者均含高拷贝数ColE1/pMB1/pBR322/pUC复制起点，本应不相容。

为排除污染，研究转化pDONR-yUtp2至DH5α，仅在LB/Zeo平板生长；转化p415GPD-3xHA-GW-attR Destination载体至DH5α，在LB/Zeo无生长（因CcdB毒性）。使用卡那霉素（carb）代替amp也观察到共转化，表明非amp突破生长所致。

共转化的正交验证和普遍性

通过EtBr存在与否的电泳进一步验证共转化。EtBr intercalates DNA，改变超螺旋程度和迁移率。未酶切质粒DNA在无EtBr凝胶中显示~5 Kbp和~2.5 Kbp条带，分别对应Expression和Entry载体；在含EtBr凝胶中条带迁移至~8 Kbp和~3.5 Kbp，确认其为质粒DNA而非染色体污染。

共转化在不同Gateway载体、插入片段、抗生素类型和大肠杆菌菌株中均发生。使用pDONR-yEmg1 Entry载体与p415GPD-3xHA-GW-attR Destination载体仍观察到共转化。使用pDONR223-CIRH1A Entry载体（壮观霉素抗性）与pGAD-T7-GW（amp抗性）和pGBK-T7-GW（卡那霉素抗性）Destination载体进行LR反应，在LB/amp/spec和LB/kan/spec平板上分别观察到~9%和~29%的共转化菌落。

在DB3.1菌株中，共转化率约11%，与DH5α的9%–29%相当。大规模筛选64个转化子，23%显示双抗生素抗性，表明共转化非稀有事件。

未筛选质粒的维持

研究 passaged 共转化菌落在无Entry载体抗生素筛选下（仅LB/amp）连续7天。所有共转化菌落始终保持Zeo抗性，表明未筛选Entry质粒稳定维持， despite 与Expression载体共享复制起点和不相容性。这与抗生素必需维持质粒的传统观念 inconsistent。

共转化机制排除

为排除异常重组产生 interlocking circles，研究将预制的Entry和Expression载体按等浓度或等拷贝数混合后转化，仍在LB/amp/Zeo平板上获得菌落，表明共转化非LR反应中 interlocking circles 所致。

讨论与建议

共转化是Gateway克隆实验设置的结果。LR反应中，未重组Entry载体以高浓度存在且未被纯化，导致共转化风险。传统克隆中，供体质粒经线性化和纯化，故无此现象。其他现代克隆方法（如Gibson Assembly、Golden Gate）因仅涉及单一载体，共转化风险较低。

研究建议简易筛选策略：LR转化后，挑取4–10个菌落，划线至LB/amp和LB/amp/Zeo（或相应抗生素）平板。仅在LB/amp生长的克隆为候选，需经BsrGI酶切验证无Entry骨架条带，或纳米孔测序确认单一质粒群体。共转化率约9%–29%，可能通过降低Entry质粒量减少，但需进一步测试。

此发现对敏感生长和 epistatic assays 具有警示意义，因共转化质粒可能影响实验结果。Gateway克隆仍以其易用、通用、准确高效为首选方法，但用户需 awareness 共转化可能性并采取相应筛选措施。